王 博，王 琳



低强度循环载荷训练对髌骨髌腱结合部损伤和髌骨微细结构的影响

王 博，王 琳

目的：本研究利用循环载荷动物模型，比较休息和低强度运动对髌骨髌腱结合部(patella-patella tendon junction, PPTJ)损伤及对髌骨的影响。实验方法：12只成年雌性新西兰大白兔，随机筛选分组分为4周循环载荷组(LD-RST，n=6)，8周循环载荷组(LD-LI，n=6)，左后肢进行实验，右后肢为空白对照。实验过程中，前4周两组实验动物统一接受强度为7.17N/S共24小时的循环载荷。在实验的第4周后，LD-RST组停止实验，LD-LI组将强度改为4.2N/共24小时的循环载荷。8周后所有动物统一进行取材，将取材后组织进行Micro-CT进行并进行H&E染色，使用图像采集系统进行组织学分析。结果：H&E染色测量纤维软骨带厚度LD-LI组和LD-RST组没有显著差异，LD-LI组的胶原排列比LD-RST组更加紧密整齐。骨量和骨小梁结果显示实验组和对照组没有显著差异。结论：4周休息不能促进髌腱结合部损伤的恢复。4周低强度的循环载荷没有加重损伤和髌骨增生，并且对肌腱的重建修复具有促进作用。

髌骨髌腱结合部损伤；循环载荷；损伤修复

髌骨髌腱结合部(patella-patella tendon junction, PPTJ)损伤是一种在篮球等长期半蹲位发力的运动项目高发运动损伤，对运动员的运动成绩和生活质量都有较大影响。目前认为，高强度的过度使用是导致其损伤的主要原因。髌骨作为膝关节屈伸的力量支点，在垂直方向长时间受到力量的牵拉作用，因此髌骨与髌腱的结合部被是损伤的好发区域[1]。髌腱结合部损伤的主要组织学表现为纤维软骨带厚度增加、纤维软骨与钙化软骨之间的潮线出现锯齿状的“涨潮”和模糊的现象，以及肌腱中胶原纤维的排列出现紊乱等，甚至出现髌腱结合部的骨质增生与钙化的问题[1-2]。与此同时，骨组织在受到外界力学条件变化后，会根据相应的力学变化改变自身的微细结构和组织密度，以适应力学条件的变化[3]。目前在对髌腱结合部损伤的治疗方法中，低强度的离心运动被认为可效减轻末端病中的红肿热痛等症状[4-6]，同时也有研究指出低强度的向心运动虽然治疗效果不如离心运动，但是同样具有减轻相应症状的效果[7-8]。这些研究主要集中临床方面，缺少相关的组织学方面研究，且休息或运动是否可以促进组织修复目前依旧存在争论。由于低强度运动会对肌腱病的治疗具有积极的影响，因此我们假设通过低强度的循环载荷训练会改善髌腱结合部的组织学损伤，并且对于骨的微细结构重建产生影响。本研究通过建立动物损伤模型，运用组织学和Micro-CT技术比较休息和低强度运动对髌腱结合部损伤及对髌骨的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

12只成年18周龄体重为2 400±200g的雌性新西兰大白兔，随机分为4周载荷4周休息组(LD-RST，6只)；4周载荷4周低强度训练组(LD-LI，6只)。6个实验动物的左后肢为实验腿，随机选取6个右后肢为对照组。

1.2 运动负荷

在之前的实验中，刺激兔股四头肌产生节律性收缩的最大电压为12V，超过12V则会产生肌肉震颤。本实验依据之前所建立的动物损伤模型[9]，并已知兔股四头肌在12V下电刺激所产生的最大伸膝力为23.5N±2.4N[9]。实验中采用30%最大负荷既7.17N(±0.3N)进行4周的循环载荷实验可以确保造模成功。从第五周开始采用10%最大伸膝力量测试低强度循环载荷训练对髌腱结合部损伤的影响。

1.3 循环载荷损伤运动

实验动物根据体重进行腹腔注射戊巴比妥钠(批号：018K0754；CAS注册号：57-33-0，SIGMA，美国。浓度：2.5%；剂量：40mg/kg。)麻醉。兔子完全麻醉后仰卧固定于兔架台上，双膝屈曲90度。将连接正极与电刺激输出装置(型号：YC-2，成都仪器厂，中国)的刺激针刺入兔子双侧股直肌中部，负极刺入股直肌髌骨止点上20mm处。实验时左下肢作为实验组接通电刺激肌肉运动，而右下肢不接通电刺激作为对照组。实验过程中通过调电压的强度(1-12V)来控制并维持兔子伸膝力的强度，伸膝力通过张力转换器(型号：YP100，北京新航业科贸有限公司，中国)将力学脉冲信号传导到多通道信号采集处理器(型号：RM-6240C，成都仪器厂，中国)，以监控整个实验过程的伸膝力强度。

在前4周，LD-RST组和LD-LI组兔子的伸膝力强度控制在7.17N(±0.3N)，骨四头肌每分钟收缩20次，每次训练2小时，每周训练3次，即两组均进行24小时循环载荷训练。LD-RST组在第四周后停止训练，继续饲养，笼中自由活动。同时8周组从第五周开始伸膝力强度控制在最大伸膝力的10%即4.2N(±0.3N)，每次训练2小时，每周训练3次，LD-LI组共进行48小时载荷训练(图1)。

图1 循环载荷损伤模型

1.4 样本取材

第九周对所有动物注射过量戊巴比妥钠处死，离断股四头肌止点，剪断内外侧副韧带和膝关节内的十字韧带，剥离髌腱下脂肪垫，将整个髌骨和髌腱结合部区域完整取下。

1.5 Micro-CT扫描

取材后标本立即进行Micro-CT扫描(skyscan 1072，美国GE公司)。扫描参数设定为：射线管电压59KV，电流159 uA，扫描分辨率9um，曝光时间600ms，采用180度扫描，采用NRecon软件(V1.6.1.0，美国GE公司)对原始图像中髌骨下缘至髌骨中部480层图像进行重建。随后对重建后所得的连续横切面灰度图像使用CTAn(V2.11, 美国GE公司)进行综合分析。根据Wang等[10]文献报道，重建图像灰度值区间设定为70-200可以有效清除清楚组织内部杂质对实验结果的干扰。随后得到完整的髌骨3D图像，并计算髌骨体积(BV)、髌骨面积(BS)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁数量(Tb.N)。(图2)。

图2 A髌腱的三维图像 B髌骨的三维图像

1.6 组织学H&E染色

Micro-CT扫描后样本放入10%甲醛溶液内固定48小时，之后使用4%甲酸溶液进行为期三周时间的脱钙。脱钙之后，沿髌骨矢状面对PPTJ组织纵向切开，进行组织脱水、石蜡包埋。待石蜡块成型后，使用石蜡切片机沿纵切面将组织切为5 um厚的石蜡切片，并对其进行伊红苏木精(H&E)染色。

对图像纤维软骨厚度带的测量采用之前已经建立的方法[11]。将整个纤维软骨带视为一个近似的矩形，使用MetaMorph Premier Offline(V7.7，美国)在100倍图像上位于软骨和肌腱之间一个带状区域中选取纤维与软骨细胞的交界部分，将其范围准确划出并计算出其面积。然后将纤维软骨带的中线划分出图像的长轴，将纤维软骨带的面积除以长轴的长度，得到纤维软骨带的厚度。

1.7 统计分析

对各组结果间纤维软骨带厚度、髌骨体积(BV)、髌骨面积(BS)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨小梁数量(Tb.N)，采用ANOVA进行统计分析差异性检验，P<0.05证明存在显著差异性。

2 实验结果

2.1 H&E染色结果

H&E组织学染色结果显示，对照组纤维软骨带与肌腱之间的潮线清晰明显，胶原排列整齐、分布比较均匀，呈波浪形。LD-RST组出现了潮线轮廓模糊甚至局部消失的现象，胶原纤维的排列呈波浪状，但排列紊乱；LD-LI组髌腱结合部的潮线轮廓出现锯齿状变化，肌腱胶原纤维排列平坦且致密。(图3)

与对照组相比，LD-RST组纤维软骨带厚度明显高于对照组(190.99±21.72um2，154.22±27.78 um2，P<0.05)，LD-LI组纤维软骨带厚度也明显高于对照组(195.91±12.01um2，154.22±27.78 um2，P<0.05)。LD-RST组纤维软骨带厚度与LD-LI组纤维软骨带厚度无明显变化(190.99±21.72um2，195.91±12.01um2，P>0.05)。(表2)

图3 100倍镜下的髌腱结合部的H&E染色和偏振光切片

表1 H&E染色测量纤维软骨厚度Table 1 The thickness of the fibrocartilage by H&E staining

2.2 髌骨体积面积

使用Micro-CT计算髌骨体积(BV)、髌骨面积(BS)和总体积(TV)，结果显示：对照组BV为36.31±6.05mm3，BS为98.71±18.75mm2，TV为116.24±21.49mm3；LD-RST组BV为34.67±7.68mm3，BS为95.58±21.73mm2，TV为116.77±18.70mm3；LD-LI组BV为：33.01±6.04mm3，BS为：95.37±20.16 mm2，TV为：108.57±16.90mm3。差异性检验结果显示LD-LI组、LD-RST组和对照组在 BV、BS、TV未见显著差异(P>0.05)。(见表2)

表2 髌骨体积与髌骨面积Table 2 The patella volume and patellar area

2.3 骨小梁数量与厚度

使用Micro-CT计算骨小梁厚度(Tb.th)和数量(Tb.N)，结果显示：对照组Tb.th为1.06±0.14mm，Tb.N为0.23±0.01 (1/mm)；LD-RST组的Tb.th为1.03±0.26mm，Tb.N为0.28±0.03(1/mm)；LD-LI组Tb.th为1.04±0.11mm，Tb.N为0.31±0.02(1/mm)；差异性检验结果显示，LD-LI组、LD-RST组和对照组在Tb.th、Tb.N未见显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 骨小梁的数量和厚度Table 3 The trabecular number and thickness

3 讨论

根据文献报道[1-2,9,12]，对于髌腱结合部损伤的H&E染色组织学表现为：肌腱纤维紊乱；潮线呈现“火焰状”变化，模糊甚至消失；纤维软骨带增厚。通过镜下观察H&E染色结果显示，LD-RST组出现了腱纤维结构紊乱，潮线模糊，部分乃至消失；LD-LI组出现了潮线锯齿状的变化。通过H&E染色测量纤维软骨带厚度，结果LD-LI组和LD-RST组的纤维软骨带厚度明显大于对照组。

3.1 髌腱结合部组织学变化

髌腱结合部损伤多为外力作用肌腱进行反复的牵拉。肌腱组织在收到牵拉后导致炎症因子升高引起红肿热痛等炎症反应，同时肌腱组织自身进行重建和修复。而在长期反复的牵拉过程中，肌腱一直处于不断的损伤，重建、修复状态，从而导致过度修复和肌腱细胞凋亡。久而久之，这种过度修复作用会形成瘢痕愈合，影响肌腱原有的特性，导致髌腱结合部损伤的发生[2,13]。纤维软骨带厚度的增加被认为是由于髌腱结合部受到反复牵拉后产生的一系列细胞凋亡与增殖的结果，H&E染色切片中的LD-RST和LD-LI的纤维软骨带厚度显著高于照组，其纤维软骨带的厚度分别是对照组的123.8%和122.5%(P均<0.05)，并且出现了潮线轮廓的变化，根据过往之前的研究结果[1-2，9，14]，可以确定4周总计24小时的循环载荷训练有效造成髌骨髌腱结合部造模损伤。LD-LI组对比LD-RST组的纤维软骨带厚度无显著性差异，说明伤后休息4周和4周的阈下强度循环载荷训练均未对纤维软骨带厚度产生影响。

LD-LI组在低强度的循环载荷运动的作用下，肌腱胶原排列平坦而紧密，而LD-RST组的胶原排列虽然已经恢复胶原中原有的波纹形态，但肌纤维的排列依旧呈现出紊乱。肌腱的重建与外界的力学变化具有紧密的联系，当肌腱受到的应力作用增加时，肌腱细胞大量合成现金属蛋白酶对肌腱中的胶原纤维进行水解[15]，同时生成新的胶原纤维对组织进行重建，而低强度的力学作用会促使组织释放如VEGF、TGF-β等因子，加速损伤的修复进行[16]。肌腱胶原纤维波纹排列的消失被认为是肌腱在牵拉力作用下所产生结构改变[12]，LD-LI由于在四周后依旧受到持续低强度的力学牵拉作用，肌腱胶原排列虽然呈现平坦，但胶原的排列紧密；LD-RST组在没有额外牵拉力的情况下，胶原纤维排列重现呈现出波纹状，但胶原排列紊乱。由此可见，虽然阈下强度循环载荷运动加强不能影响髌腱结合部纤维软骨带厚度，但相对LD-RST组的胶原纤维结构，LD-LI组的胶原纤维重新形成了紧密的结构，因此我们认为低强度循环载荷训练可以促进肌腱的重建。

3.2 骨量与骨微细结构变化

髌骨下缘作为髌腱通附着点，承受着从髌腱传递而来的纵向牵拉力作用，由于长期受到牵拉作用，髌尖区域是骨质增生的好发区域，也是髌腱结合部损伤后期的常见症状之一，而低强度的牵拉力是否会引起髌骨下缘的骨质增生尚不明确。通过Micro-CT计算结果显示，LD-RST组、LD-LI组与对照组的髌骨体积(BV)与髌骨面积(BS)无显著差异；骨小梁厚度(Tb.th)与骨小梁数量(Tb.N)结果无显著差异。骨小梁是骨重建的重要指标，其变化是指示骨组织中成骨细胞和破骨细胞活性以及骨组织应对外界力学条件变化的结果；骨体积和骨面积的变化是骨小梁重建的最终结果，是整个骨重建的宏观体现[10]。在一般情况下，骨骼的成骨和破骨处于一个相对的稳定的动态平衡。而外界压力和牵拉力的长时间增高并超出阈值时，这种平衡关系就会被打破。此时，成骨细胞的活性大大超过破骨细胞，使骨小梁密度增高，骨量增加。在对大鼠骨小梁结构与力学关系的研究中[17]，悬吊大鼠进行每天进行1小时的站立可以改善骨小梁数量和厚度降低的情况，但与对照组依旧存在显著差异，而且悬吊组和1小时站立组的骨小梁数量和密度没有显著差异。在前一阶段的实验结果中显示[13]在髌骨髌腱结合部损伤造模后，会出现局部骨质增生的情况。而在本研究中，LD-RST和LD-LI组与对照组髌骨下缘区域的骨量和骨小梁结构均没有显著差异。由此我们推测，LD-RST组在进行4周实验后，在后4周由于停止载荷训练，骨的微细结构恢复到对照组水平；而在LD-LI组由于后4周处于损伤阈下强度训练，其载荷强度不足以维持骨小梁已经重建的结构，且由于肌腱牵拉力的降低，导致已经重建的骨微细结构对外界力学变化进行再次进行重建，使得骨微细结构恢复到接近对照组水平。髌腱结合部髌骨骨质增生是骨腱结合部损伤后期常见的症状，而损伤阈下强度的循环载荷训练并没有增加髌骨的骨密度以及骨小梁厚度和数量。由此我们认为损伤阈下强度的循环载荷运动不会引起髌骨骨质增生。

4 结论

本研究通过4周循环载荷进行损伤造模，通过组织学角度证明4周休息不能促进髌腱结合部损伤的恢复。4周损伤阈下强度的循环载荷没有加重损伤和髌骨增生，并且对肌腱的重建修复具有促进作用。低强度训练对促进髌腱结合部伤后早期恢复具有可行性，其效果有待进一步研究。

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(编辑 孙君志)

The Effect of Low Intensity Cyclical Load on the Patella-patella Tendon Junction Injury and Patella Microstructure

WANG Bo, WANG Lin

Objective: This study was to compare the effects of rest and low intensity exercise on tendon patella-patella junction (PPTJ) injury and patella with a cyclic loading animal injury model. Experiment design: 12 adult female New Zealand white rabbits were randomly assigned to a four-week cyclical load group (LD-RST,n=6) and a 8-week cyclical load group (LD-LI, n=6). During the experiment in the first 4 weeks, the two groups of rabbits received cyclical load of 7.17N/S·24 hours. After four weeks, the experiment on the LD-RST group was stopped and the load on the LD-LI group was changed into 4.2N/S·24 hours. After 8 weeks, tissues were collected from all the rabbits. The collected tissues were first scanned by Micro-CT and treated by H&E staining and then used for histological analysis by the image acquisition system. Results: There was no significant difference between the LD-LI group and the LD-RST group in the thickness of the fibrocartilage by H&E staining, and the collagen array in the LD-LI group is tighter and more regular than the LD-RST group. There is no significant difference in patellar microstructure between the experimental group and the control group. Conclusion: 4 weeks of rest can not promote the recovery of bone tendon junction injury. 4 weeks of low intensity of cyclic loading did not aggravate the damage and patella hyperplasia, and can promote the tendon reconstruction and repair.

TendonPatella-patellaJunction(PPTJ)Injury;CyclicalLoad;TendonRepair

G804.5 Document code：A Article ID：1001-9154(2016)02-0088-05

国家自然科学基金项目(30871209)。

王博，北京体育大学在读博士，研究方向：运动损伤与肌腱末端病，E-mail：wangbodc002@163.com。

北京体育大学运动康复系，北京 100084 Beijing Sports University, Beijing 100084

2015-10-29

2016-01-29

G804.5

A

1001-9154(2016)02-0088-05