王 宇,孔祥瑞,李成久

( 辽宁省水产苗种管理局，辽宁 大连 116000 )

气相色谱—质谱法测定水产品中己烯雌酚的不确定度分析评定

王 宇,孔祥瑞,李成久

( 辽宁省水产苗种管理局，辽宁 大连 116000 )

依据测量不确定度评定与表示理论，从标准溶液、样品称量、样品定容、标准曲线、样品测定和测量仪器6个方面，对气相色谱—质谱法测定水产品中己烯雌酚的不确定度进行分析和评定。结果表明，标准曲线拟合和样品测量重复性这两个分量对测量结果的不确定度贡献较大，这为减少测量不确定度，提高测量准确度提供改进方向。以平均值报告水产品中己烯雌酚含量为7.58 μg/kg时，扩展不确定度为2.20 μg/kg。

不确定度；气相色谱—质谱法；己烯雌酚

己烯雌酚为无色结晶或白色结晶性粉末，是人工合成的二苯乙烯类雌激素，能够促进动物生长[1]，但其又具有潜在致癌性，我国在水产养殖中严格禁止己烯雌酚作为动物饲料添加剂添加。2002年农业部在第235号公告《动物性食品中兽药最高限量》中要求[2]，己烯雌酚在动物性食品的可食用部分中要求不得检出。由于一切测量结果都不可避免具有不确定度[3]，故附有表征这种分散性的测量不确定度的测量结果才更完整，更能为判定测量结果的准确性提供依据。本次试验采用农业部1163号公告—9—2009《水产品中己烯雌酚残留检测气相色谱—质谱法》方法[4]，对影响测量结果不确定度的分量进行评定、计算、合成，进而找出影响己烯雌酚测量结果的主要因素，通过对这些主要影响因素进行持续改进，为实验室质量管理和质量控制提供更为科学准确的数据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

7000B三重四级杆气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)；ALC210.4电子天平(Ⅰ级)；LD610-2电子天平(Ⅲ级)；SLH固相萃取柱(500 mg，6 mL)；WH-2漩涡混合器；Stratos高速冷冻离心机；5085氮吹仪；Agilent固相萃取仪。

1.2 试剂

己烯雌酚标准品(纯度99.5%)；N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺/三甲基氯硅烷体积比99∶1；乙酸乙酯、甲醇、正己烷均为色谱级；无水乙醚；无水碳酸钠。

1.3 试验方法

1.3.1 提取

称取匀浆样品5 g于50 mL离心管中，加10%(m/V)碳酸钠溶液3 mL，乙酸乙酯20 mL，均质30 s，7000 r/min离心10 min，移取乙酸乙酯，再加10 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯， 40 ℃旋转蒸发至干。用2 mL正己烷和乙酸乙酯(体积比85∶15)混合溶液溶解残留物，备用。

1.3.2 净化

依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化SHL固相萃取柱，取备用液过柱，依次用2 mL正己烷，2 mL正己烷和乙酸乙酯(体积比85∶15)混合溶液淋洗小柱并抽干，再用10 mL正己烷和乙酸乙酯(体积比80∶20)混合溶液洗脱，洗脱液于50 ℃水浴中氮气吹干，用1 mL无水乙醚溶解，转至2 mL去活样品反应瓶中氮气吹干。

1.3.3 衍生化

反应瓶中加100 μL衍生化试剂，混合30 s，80 ℃烘箱中衍生30 min，氮气吹干。准确加入0.5 mL正己烷，混匀10 s，待测定。

己烯雌酚标准工作液于2 mL去活样品反应瓶中氮气吹干，衍生化同上。

1.4 测定

分别吸取1.0 μL标准溶液及净化后的样品溶液进行气相质谱分析。样品峰与标准物质的保留时间之差不大于0.10 min，扣除背景后所选择的离子均出现，以多点校准定量。

1.5 质谱条件

EI源；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；溶剂延迟12 min；选择离子监测己烯雌酚衍生物(质子数/电荷数)383、397、412、413。

1.6 标准溶液配制

准确称取0.0050 g己烯雌酚标准品，甲醇定容于50 mL容量瓶中，该溶液为100 μg/mL标准储备液。

以甲醇为稀释液，用1、5 mL分度吸管和10、50、100 mL容量瓶逐级稀释，配制成质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.25 μg/mL的标准工作液，衍生后测定。

2 结果与分析

2.1 测量不确定度的主要来源

从测量和计算两方面分析己烯雌酚测定引入的不确定度，主要是由标准溶液、样品称量、样品定容、标准曲线、样品测定和测量仪器6个方面引入。对标准溶液、样品称量、样品定容、测量仪器和标准曲线部分分量的评定，数据主要来自标准物质证书、检定证书、说明书和其他文件提供的数据和准确度等级，采用B类不确定度评定；对标准曲线拟合和重复测定样品引入的不确定度采用A类不确定度评定。

2.2 标准溶液配制引入的不确定度

2.2.1 标准物质纯度的不确定度

查己烯雌酚标准物质证书，得到己烯雌酚的纯度为99.5%,不确定度为U=0.5%,按正态分布，包含因子取k=2，则标准不确定度为u(Cs)=U/k=0.25%，相对标准不确定度urel(Cs)= 0.25%/99.5%=0.0025。

2.2.2 标准品称量的不确定度

2.2.3 标准溶液定容的不确定度

2.2.4 环境条件变化的不确定度

由上可见，标准溶液定容引入的不确定度相对较小，忽略不计。由标准物质纯度、标准物质称量及温度变化引入不确定度经合成为标准溶液引入的不确定度urel(Cb)=0.0204。

2.3 样品称量引入的不确定度

2.4 定容体积引入的不确定度

2.4.1 样液定容的不确定度

2.4.2 进样体积的不确定度

以上，由提取衍生液定容和进样体积引入的不确定度经合成为样品定容的不确定度urel(V)=0.0130。

2.5 标准曲线引入的不确定度

2.5.1 标准溶液稀释的不确定度

2.5.2 标准溶液移取的不确定度

2.5.3 采用最小二乘法拟合基质匹配标准工作曲线的不确定度

5个不同质量浓度的己烯雌酚标准工作液衍生化后，得到顺反两种结构己烯雌酚衍生物，相应峰面积为yi，每个质量浓度的标准溶液重复测定3次。采用最小二乘法拟合，得到标准工作曲线的线性回归方程y=a+bx(a为截距，b为斜率)和方程的详细相关系数(表1)。

表1 标准工作曲线线性回归方程拟合结果

顺式己烯雌酚衍生物:回归方程y=3490.9442x-18.4546，相关系数r2=0.9997；反式己烯雌酚衍生物:回归方程y=11022.6248x+17.4278， 相关系数r2=0.9998.

由标准曲线校准得到的被测物含量xc的不确定度u(xc)=S(xc)，可按下式求得：

其中：

以上， 由标准溶液稀释、标准溶液衍生化及标准曲线拟合引入不确定度合成为标准曲线引入的不确定度urel(B)=0.0480。

2.6 样品测量重复性引入的不确定度

以己烯雌酚质控样品作为待测样，在相同的条件下，按试验方法进行6次测定，得到顺反两种结构己烯雌酚衍生物的质量浓度和响应值(表2)。

表2 己烯雌酚衍生物测定结果表

6次测定样品的重复性标准差s，即为标准不确定度u(c)。按下式计算：

2.7 测定仪器引入的不确定度

2.8 合成和扩展不确定度

2.8.1 合成相对标准不确定度

由标准溶液、样品称量、样品定容、标准曲线、样品测量和测量仪器等6个方面引入的不确定度，通过合成得到相对合成标准不确定度urel(M)=0.145。

0.145

2.8.2 扩展不确定度

在一般情况下，取置信水平95%，包含因子k=2，则相对扩展不确定度U=kuc(M)=2×1.10=2.20 μg/kg。

3 讨 论

评定发现，影响测量结果的6个分量对测量结果的不确定度贡献大小不同。其中由样品重复测量引入不确定度对测量结果影响最大，这对样品前处理过程包括操作熟练度、人员因素和环境条件等提出改进要求。其次是由标准曲线拟合引入，试验发现非同一次衍生，形成顺反两种结构己烯雌酚衍生物的量比具有不确定性，本次试验由于标准物和样品非同一次衍生，分析由此引入了较大不确定度。试验同时发现，因称量引入的相对标准不确定度可达0.02，不可忽视。如果做单次测量有增大不确定度的风险。故试验建议：(1)样品和标准品最好同一次衍生化。(2)称量过程使用精密度高的天平。(3)尽可能做双平行试验。

4 结 论

采用农业部1163号公告-9-2009《水产品中己烯雌酚残留检测气相色谱-质谱法》测定水产品中己烯雌酚含量，以平均值报告结果和扩展不确定度为(7.58±2.20) μg/kg，包含因子k=2，扩展不确定度为2.20 μg/kg。

[1] 邴爱英,李坤林，牛钟相.己烯雌酚免疫分析技术研究进展[J].动物医学进展，2006,27(4)：51-54.

[2] 农业部.中华人民共和国农业部公告第235号.动物性食品中兽药最高残留限量[M].北京：中国农业出版社，2002.

[3] 国家质量技术监督局.JJF1059-1999.测定不确定度评定与表示[M].北京：中国计量出版社，1999.

[4] 中华人民共和国农业部渔业局.农业部1163公告-9-2009.水产品中己烯雌酚残留检测气相色谱-质谱法[S].北京：中国农业出版社，2011.

[5] 国家质量监督检验检疫总局.JJG196-2006，常用玻璃量器检定规程[M].北京：中国计量出版社，2007.

[6] 朱凯.HPLC法测定片剂中双氢青蒿素含量的不确定度评估[J].工商大学学报：自然科学版，2003,30(1)：81-85.

EvaluationofUncertaintyinDetectionofDiethylstilbestrolResiduesinFisheryProductsbyGC-MS

WANG Yu，KONG Xiangrui，LI Chengjiu

( Aquatic Seedlings and Fingerlings Management Bureau of Liaoning Province，Dalian 116000，China )

The uncertainty of diethylstilbestrol residues in fishery products detected by gas chromatography-mass spectrometry method was evaluated from standard solution，sample weighing，sample constant volume，calibration curve，sample and detecting instrument used based on measurement uncertainty evaluation and representation theory.The results showed that calibration curve fitting and sample detection were on the most extent involved in the uncertainty，which provided an improvement direction for the reduction in measuring uncertainty and increase in measuring accuracy.The average report of diethylstilbestrol residues in fishery products was calculated to be (7.58±2.20) μg/kg，with uncertain extension of 2.20 μg/kg.

uncertainty; GC-MS; diethylstilbestrol

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.016

S912

A

1003-1111(2016)03-0284-05

2015-08-08；

2015-10-08.

王宇(1979-)，女，硕士；研究方向：水产苗种质量安全与检测.E-mail：18625038@qq.com.