刘品华，林 慧，刘明研，余丽访，杨 芬 *

(1.曲靖师范学院化学化工学院，云南 曲靖 655011；2.广西百色农业学校，广西 百色 533000)



干巴菌废弃料酶水解优化条件及黄酮、多糖含量的研究

刘品华1，林 慧1，刘明研2，余丽访1，杨 芬1 *

(1.曲靖师范学院化学化工学院，云南 曲靖 655011；2.广西百色农业学校，广西 百色 533000)

测得野生干巴菌废弃料(干固形物)中总氨基酸态氮为0.376 g/100g、总黄酮为6.158 mg/g、多糖为1.587 g/100g。研究了用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶水解的优化条件及总黄酮、多糖的变化。结果表明，鲜干巴菌︰水=1︰4的条件下，酶水解最佳条件为：木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)≥0.75 g/100 mL、时间7 h、pH值6.5、温度65 ℃，干固形物中总氨基酸态氮为0.933 g/100 g，总黄酮3.868 mg/g，多糖1.792 g/100 g；菠萝蛋白酶(300 U/mg)1 %～1.25 %、时间7 h、pH5、 温度35 ℃，干固形物中总氨基酸态氮为0.772 g/100g，总黄酮4.968 mg/g，多糖2.192 g/100 g。木瓜蛋白酶表现了较好的水解效果。

干巴菌；酶水解；氨基酸态氮；黄酮；多糖

野生干巴菌(ThelephoraganbajunZang) 主要生长于亚热带云南松林或针阔混交林下，是一种狭域性分布的可食高等真菌，同其它食用菌相比，干巴菌不仅具备独特、浓郁的鲜香味，也含有大量的营养物质，如氨基酸、蛋白质、矿质元素、维生素等，具有很高的营养保健价值[1]。干巴菌在云南省主要分布在昆明、呈贡、嵩明、安宁、楚雄、易门、保山、曲靖、马龙等州市(县) ，其分布区大约在北纬22°～27°，东经99°～106°，集中在海拔1000～2200 m的松林中，调查资料表明，云南省干巴菌年产量超过10 000 t[2-3]。干巴菌为云南特有珍稀野生菌[4]，由于生长环境和菌体特性，在菌体下部夹带沙土等杂质，清理后有约1/4的量被废弃。通过酶水解工艺可有效的去除菌体中的杂质，保留原有的营养成分和香味，使原来蛋白质的功能特性发生很大变化，对水解工艺进行优化和控制具有十分重要的现实意义[5]。为此笔者对废弃的干巴菌部分进行了蛋白酶水解、黄酮、粗多糖的研究，旨在充分利用珍稀资源，为综合开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜干巴菌的废弃部分(由云南曲靖马龙金发酒楼提供)；木瓜蛋白酶(≥800 U/mg，BR，for laboratory use only，not for drug or other uses)；菠萝蛋白酶(30万U/g，食品添加剂，南宁东恒华道生物科技有限责任公司)；芦丁(中国药品生物制品检定所)；葡萄糖(天津市风船化学试剂科技有限公司)；硫酸(重庆川东化工有限公司)；苯酚(天津市化学试剂三厂)；亚硝酸钠(北京红星化工厂)；硝酸铝(上海三浦化工有限公司)；无水乙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司)、甲醇(天津市风船化学试剂科技有限公司)；氢氧化钠(天津市化学试剂三厂)，试剂均为分析纯。

1.2 仪器

pH仪(PP-20-P11，赛多利斯科学仪器有限公司)；超级恒温水浴(HH-501，常州国华电器有限公司)；紫外可见分光光度计(TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司)；组织捣碎均浆机(JJ-2 型，常州市顶新实验仪器有限公司)；电子分析天秤(AL204-IC，梅特勒-托利多仪器有限公司)；旋转蒸发仪(N-1100 ，上海爱朗仪器有限公司)；磁力加热搅拌器(78-1型，上海南汇电讯器材厂)；AS-3120型超声波机(Autoscience)。

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理 按鲜干巴菌的废弃料部分1份，水4份的比例放入组织捣碎均浆机捣碎，得预处理待用液。

1.3.2 正交试验设计 预处理待用液400 mL。酶用量、pH值、温度因素参考通用的使用范围设定。

表1 木瓜蛋白酶水解正交实验

时间考虑到酶活性与时间的关系，最大设置到8 h。本实验采用L16(44)正交设计方案，试验结果见表1、表2。

1.3.3 单因素试验设计 在正交试验的基础上为测定酶含量的影响，考察了酶的用量与水解的关系。木瓜蛋白酶的试验量为0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750 g/100mL，菠萝蛋白酶的试验量为0.250、0.500、0.750、1.000、1.250、1.500 g/100mL，试验结果见图1～2。

1.3.4 总氨基酸态氮的测定 分别取预处理待用液、木瓜蛋白酶水解液、菠萝蛋白酶水解液，压滤过80目滤网得检测滤液。于200 mL烧杯中取80.0 g检测滤液，置于电磁搅拌机上，待搅拌稳定后把校准的酸度计的复合电极放入烧杯的适合位置，用0.0464 mol/L的氢氧化钠标准滴定液滴定至pH值8.2，准确加入10.00 mL甲醛，再用氢氧化钠标准滴定液滴定至pH值9.2，记录消耗氢氧化钠标准滴定液的体积(mL)，同时做空白实验。计算公式：

其中，X为样品干粉中总氨基酸态氮的含量，g/100g；V1为测定样品加入甲醛后滴定至终点(pH值9.2)所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2为空白实验加入甲醛后滴定至终点(pH值9.2)所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；0.1757为每1.0000g鲜干巴菌废弃料中干固形物含量。

1.3.5 总黄酮的测定 精确称取免烘干的芦丁对照品0.0168g，置50mL容量瓶中，加50 %甲醇适量，振摇溶解，并稀释至刻度，即得质量浓度为0.3360mg/mL芦丁溶液。精确量取上述对照品溶液0.00、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10、2.40mL。分别置于10mL容量瓶中，加入无水甲醇3mL，5 %的亚硝酸钠溶液0.60mL，摇匀，放置6min，加10 %的硝酸铝溶液0.60mL，摇匀，放置6min，再加入8.6 %氢氧化钠3mL，用50 %甲醇定容至刻度，在508.00nm波长处测定，以芦丁对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出线性回归方程：y=1.0171x+0.0024，R2=0.9989。

图1 木瓜蛋白酶水解干巴菌Fig.1 Papain hydrolyzed Sparassia Thelephora ganbajun

取预处理待用液、木瓜蛋白酶水解液、菠萝蛋白酶水解液，以105 ℃烘干，恒重后粉碎，分别取粉末样品1.0000g，于50mL容量瓶中，加入50 %的甲醇(约35mL)，在40 ℃水温中超声波萃取1.5h，冷却定容，静置过夜。然后过滤，前10mL滤液弃之，之后的滤液待测总黄酮含量。精确量取待测总黄酮滤液2.00mL置10mL容量瓶中，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀作为空白对照样。另精确量取滤液2.00mL置10mL容量瓶中，照芦丁标准曲线建立中的显色方法依次加入显色剂，依法测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.3.6 粗多糖的测定 参照NY/T1676《食用菌中粗多糖含量的测定》方法检测。葡萄糖浓度为横坐标，490nm测吸光度为纵坐标，标准曲线回归方程：y=10.5248x+0.0 838，R2=0.9991。取预处理待用液、木瓜蛋白酶水解液、菠萝蛋白酶水解液，以105 ℃烘干，恒重后粉碎取样检测，计算粗多糖含量。

1.3.7 香气评价 评价样品编号后，倒入50mL烧杯中，通过静置状态和摇动状态，经10人的嗅觉感官按照表3设计进行评价。评价表述采用味最浓为10，味最淡为0的累加统计比较方法。

1.3.8 干固形物含量的测定 干巴菌废弃料均匀后，用扁形称量瓶，按照GB/T5009.3中直接干燥法进行测定。

图2 菠萝蛋白酶水解干巴菌Fig.2 Bromelain hydrolyzed Sparassia Thelephora ganbajun

2 结果与分析

2.1 酶水解试验

木瓜蛋白酶水解温度超过70 ℃后才开始下降，具有耐高温的特性，最适反应温度约为65 ℃，在pH值6.8～7.6活性较高[6-8]。由表1可以看出，温度对酶水解有显著影响，酶的用量影响最小。正交结果优化方案为水解温度65 ℃、pH值6.0、时间7h、木瓜蛋白酶用量为正交设计最大值0.5g/400mL(水解液中酶含量约为1000U/g)，水解测得总氨基酸态氮含量为0.791g/100g。

pH值5.5时，菠萝蛋白酶活力保留率达最高，液体菠萝蛋白酶的活力随温度的升高而显著下降[9]。由表2可以看出,菠萝蛋白酶水解时温度有较大的影响，酶的用量和时间因素影响次之，酸度因素影响最小。正交实验优化方案是温度35 ℃，菠萝蛋白酶用量为正交设计的最大值1.2g(水解液中酶含量约为900U/g)，时间7h，pH值6.0，水解测得总氨基酸态氮含量为0.700g/100g。

从图1可知,木瓜蛋白酶的含量在0.75g/100mL内随着酶含量的增加水解效率也随之上升，酶含量为0.75g/100mL时测得氨基酸态氮为0.933g/100g。

从图2可知,菠萝蛋白酶用量达到1g/100mL以后水解效率提高不明显，最佳菠萝蛋白酶用量应为1～1.25g/100mL，测得氨基酸态氮为0.772g/100g。

从表3可看出，对水解前后的干巴菌气味评价基本没有明显变化。由此得出最佳水解条件为：木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)≥0.75 g/100mL、时间7 h、pH值6.5、温度65 ℃；菠萝蛋白酶(300 U/mg)1～1.25 g/100mL、时间7 h、pH 5、 温度35 ℃。

表2 菠萝蛋白酶水解正交实验

表3 气味感官评价

2.2 总黄酮的检测

黄酮类化合物泛指2个具有酚羟基的苯环通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物，广泛存在于果蔬中，无毒副作用，有显著的清除人体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂、降血压等药理保健功能[10-11]，在防癌和抑制脂肪酶等方面也有明显效果[12]。近年研究表明，芦丁及其衍生物具有抗氧化活性和广泛药理活性[13]，及抗痉挛、抗癌、抗血小板、抗病毒作用[14]。黄酮类化合物是重要的具有开发前景的天然有机抗氧化剂。从标准曲线回归方程得出未水解干巴菌、木瓜蛋白酶水解干巴菌、菠萝蛋白酶水解干巴菌中总黄酮相当于芦丁的含量6.158、3.868、4.968 mg/g。

2.3 粗多糖的检测

多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，几乎存在于所有的生物中，是构成生命活动的四大基本物质之一。有研究表明植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂等多种重要生理活性。国内外近年来对于植物多糖的抗氧化作用进行了广泛的研究[15-16]。从标准曲线回归方程得出未水解干巴菌、木瓜蛋白酶水解干巴菌、菠萝蛋白酶水解干巴菌中粗多糖含量为1.587、1.792、2.192 g/100g。

2.4 干固形物检测

测得鲜干巴菌废弃料固形物含量为17.57 %，其余为水分及挥发性成分。

3 讨 论

(1)干巴菌干固形物中氨基酸态氮、总黄酮、粗多糖含量分别为0.376、6.158、1.587 g/100g。

(2)木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶能较好的通过水解提高干巴菌水解液中氨基酸态氮的含量，木瓜蛋白酶的水解效果优于菠萝蛋白酶。最佳水解条件：木瓜蛋白酶用量≥0.75 g/100mL、温度65 ℃、pH值6.0、时间7 h，水解后干固形物总氨基酸态氮含量为0.933 g/100g；菠萝蛋白酶用量1.00～1.25 g/100mL、温度35 ℃、pH值6.0、时间7 h，水解后干固形物总氨基酸态氮含量为0.772 g/100g。

(3)木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶水解后，总黄酮分别下降2.290、1.190 mg/g，粗多糖含量分别提高0.205、0.605 g/100g。

(4)通过水解工艺可除去含在干巴菌中的杂质，得到富含氨基酸、黄酮、粗多糖的水解液，在提高营养成分的前提下保持原有的香气特征不变。试验证明珍稀干巴菌1/4的废弃料可以通过水解得到充分利用。

[1]吴少雄,王保兴,郭祀远,等.云南野生食用干巴菌的营养成分分析[J].现代预防医学,2005,32(11):1548-1549.

[2]邰丽梅,赵春艳,郭 相,等.云南几类野生食(药) 用菌资源开发应用前景[J].中国食用菌,2013,32(2):4-6.

[3]桂明英,刘 蓓,朱 萍,等.干巴菌生态学初步研究[J].西南农业学报,2005,18(3):325-327.

[4]陈亚萍,邱开雄,陈亚娟,等.干巴菌抗氧化活性研究[J].昆明医学院学报,2012(1):40-42.

[5]高丹丹,徐纪平,李贞子.木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白水解条件的研究[J].食品工业科技,2012,33(8):267-271.

[6]徐素玲,卢帮贵,李镁娟.木瓜蛋白酶改性玉米谷蛋白水溶性的工艺优化[J].食品与机械,2013,29(4):190-193.

[7]王丽彬,张 弢,王 旻.高纯度木瓜蛋白酶的分离纯化和性质研究[J].中国生化药物杂志, 2006,27(3):159-162.

[8]李 婷,赵沙沙,阮奇珺,等.碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对热变性大豆分离蛋白的酶解研究[J].中国油脂,2014,39(4):35-38.

[9]潘江球.影响菠萝蛋白酶活力主要因素的研究[D].华南热带农业大学,2003.

[10]刘品华,金亚蓉,刘明研,等.臭参地上部分总黄酮含量及抗氧化活性的研究[J].西南农业学报,2014, 27(5):1894-1898.

[11]黄 鑫，梁剑平，郝宝成.黄酮类化合物的分子修饰与构效关系的研究[J].安徽农业科学,2015,43(11):57-61.

[12]贾 征,黄 文,薛安杜.仲叶黄酮的超声提取及其抗氧化性研究[J].安徽农业科学,2008,36(4):1286-1288.

[13]Yang J X,Guo J,Yuan J F.In vitro antio xidant propert ies of rutin [J].LWT-Food Science and Technology,2008,41:1060-1066.

[14]贾贵东,杨建雄,王 莉,等.芦丁与绿原酸协同抗氧化活性研究[J].陕西师范大学学报,2010,38(5):61-64.

[15]刘品华,黄玉梅,金亚蓉.臭参多糖含量的测定及抗氧化活性的研究[J].食品科技,2013,38(8):282-286.

[16]王晓林，钟方丽，陈 帅，等.超声波协同复合酶法提取锦灯笼宿萼多糖工艺优化[J].南方农业学报,2015,46(6):1079-1084.

(责任编辑 王家银)

Enzymatic Hydrolysis of Waste Materials fromSparassiaThelephoraGanbajunand Content of Flavonoids/ Polysaccharides

LIU Pin-hua1, LIN Hui1, LIU Ming-yan2, YU Li-fang1, YANG Fen1 *

(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University, Yunnan Qujing 655011, China; 2. Guangxi Baise Agriculture School, Guangxi Baise 533000, China)

The contents of amino acid nitrogen, flavonoids, and polysaccharides of waste materials from wildSparassiaThelephoraganbajun(dry substance) were 0.376 g/100g, 6.158 mg/g, and 1.587 g/100g, respectively. The optimized conditions of enzymatic hydrolysis of the waste materials were studied by papain and bromelain through detection indicator of amino acid nitrogen, then the contents of flavonoids and polysaccharides were researched before and after hydrolysis. The optimal condition of enzymatic hydrolysis was determined as follows: papain (≥ 800 U/mg) ≥0.75 g/100mL, hydrolysis time: 7 h, pH value=6.5, hydrolysis temperature: 65oC. Under the condition, the contents of amino acid nitrogen, flavonoids and polysaccharides in dry substance were 0.933 g/100g, 3.868 mg/g and 1.792 g/100g. Bromelain (300 U/mg) 1 %-1.25 %, hydrolysis time: 7 h, pH value =5, hydrolysis temperature: 35oC. The contents of amino acid nitrogen, flavonoids and polysaccharides were 0.772 g/100g, 4.968 mg/g, and 2.192 g/100g. Papain exhibits better in the enzymatic hydrolys.

SparassiaThelephoraganbajun; Enzymatic hydrolysis; Amino acid nitrogen; Flavonoids; Polysaccharides

1001-4829(2016)08-1949-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.017

2014-11-27

上海师范大学资源化学省部共建教育部重点实验室；曲靖师范学院资源与环境化学重点实验室(SYS2010BX01)

刘品华(1963-)，男，教授，从事食品化学、分析方面的研究工作，E-mail:406051584@qq.com，*为通讯作者，E-mail:yangfen6688@163.com。

TQ281

A