刘声传，鄢东海，周 雪，莫 雪，胡依然，魏 杰，周富裕，周玉锋

(贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州 贵阳 550006)



茶树CsSMT基因的单核苷酸多态性及其表达

刘声传，鄢东海，周 雪，莫 雪，胡依然，魏 杰，周富裕，周玉锋*

(贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州 贵阳 550006)

为了发掘利用茶树茶树富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(Selenocysteine methyltransferase, SMT)基因CsSMT，通过RACE克隆该基因的cDNA全长，并通过水培试验，分析该基因在井43幼苗根叶的表达特征。结果表明：通过该基因cDNA的全长克隆，获得5个茶树品种CsSMT的开放阅读框(ORF)全长；对茶树5个品种的ORF核苷酸多态性鉴定共检测到19个多态性位点，包括17个SNPs和2个InDels，平均每55 bp检测到1个多态性位点，这些多态位点引起9个氨基酸位点变化；5个茶树品种SMT的氨基酸序列一致性为99.15 %，出现一定的遗传分化。Na2SeO3水培及荧光定量PCR表明，CsSMT基因在茶树幼苗根与成熟叶中均有表达；Na2SeO3显著诱导成熟叶中该基因表达，抑制须根CsSMT表达。

茶树；硒；CsSMT；核苷酸多态性；表达模式

硒是人体必需的一种微量元素，对人体具有多种保健功能[1]。然而，我国缺硒地区较广，约2/3的人口存在不同程度的硒摄入量不足[2]。茶为世界三大无酒精饮料之一，茶树(Camelliasinensis)可将土壤中的硒富集于叶片，而为人体提供安全保健的天然有机硒[3-4]。茶树种质资源丰富、遗传多样性高，不同茶树品种叶片对硒的富集能力存在差异，一些硒代谢酶基因在茶树叶片硒的富集过程中起着关键调控作用。

硒代半胱氨酸甲基转移酶(Selenocysteine methyltransferase, SMT)是茶树等植物硒代谢途径中的一个关键酶，催化硒代半胱氨酸进行甲基化反应生成甲基硒代半胱氨酸(Methylselenocysteine, MeSeCys)(一种氨基酸衍生物，具抗癌功能)，从而减少硒对蛋白质的掺入，解除硒对茶树的毒害，使茶叶安全富集硒源[5-7]。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是基因组单个核苷酸由于转换、颠换、插入、缺失等引起的变异。插入-缺失(Insertion-deletion indel, InDel)是指核苷酸小片段的插入或缺失。广义的SNP包括InDel，是最丰富的遗传变异，广泛而稳定地存在于植物基因组中，SNP变异可能影响基因的功能。例如，茶树查尔酮合成酶(Chalcone synthase, CHS)是类黄酮合成途径的关键酶，CsCHS1和CsCHS2中分别存在2个和4个与茶叶多酚含量相关的SNP位点[8]；魏艳丽[7]研究发现，茶树咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase, TCS)基因TCS1的一个点突变与咖啡碱含量显著相关；大麦Wx的多态性与直链淀粉含量之间存在明显的对应关系[10]。虽然已从茶树中克隆了CsSMT并进行了初步验证，但鲜见茶树品种间该基因的SNP及表达特性分析[11]。为此，本研究克隆了5个茶树品种叶片中CsSMT的cDNA全长，分析该基因单核苷酸多态性；通过水培试验，结合qRT-PCR技术分析CsSMT在茶树幼苗须根与成熟叶中的表达，为进一步研究该基因如何调控茶树硒代谢及筛选富硒茶树品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试茶树品种、菌株、载体及试剂

供试品种为福鼎大白茶、贵定鸟王茶、龙井43、宁州2号和祁门种，均采于贵州省茶叶研究所茶树资源圃。PrimeScriptTMRT、TaKaRa LATaq酶、rTaq酶、PrimeSTAR@HS (Premix)、PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、pMD 18-T Vector Cloning Kit、dATP、E.coliDH5α Competent cells和SYBR Premix ExTaqTMII均购自TaKaRa公司。AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。

1.2 目的基因cDNA的全长克隆

基于课题组前期已克隆的宁州2号SMT基因cDNA的全长序列[12]，设计CsSMT全长扩增引物：正向引物GGGTGTTATGTTCTTGGTG和反向引物TGTCAGTTAATCAGTGGGAT，进行其他4个品种该基因的开放阅读框(Open reading frame, ORF)扩增。采用Qiagen试剂盒(Qiagen, 德国)提取茶叶总RNA，利用PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，连接至T-Vector pMD18，转化E.coliDH5α 感受态细胞，菌落PCR鉴定、测序[12]。

1.3 目的基因开放阅读框单核苷酸及其编码氨基酸多态性

利用DNAstar软件包内的EdiSeq程序查阅ORF并翻译成氨基酸序列。利用DNAman软件对来自不同材料的序列进行单核苷酸和氨基酸多态性分析。利用Mega6软件对目的基因的氨基酸与其它物种同源氨基酸序列进行系统发育分析。

1.4 茶树水培及表达分析

选取生长势一致的一年生龙井43扦插幼苗，先用自来水洗净茶树根系上的土壤，再用去离子水冲洗2次。将茶树定植于黑色塑料盆(高40 cm×内径30 cm)中，外套上不透光塑料平板，用营养液(pH调为6.0)进行预培养[13]。用通氧泵连续通气，每7 d更换1次营养液，预培养60 d左右，待茶树根部长出大量白色吸收根后, 将其分成4组：即0、5、10和20 mg/L的Na2SeO3。处理24 h后，取成熟叶片和须根，用去离子水洗净，吸干表面水分，液氮速冻后于-80 °C保存备用。

采用Qiagen试剂盒提取茶叶总RNA，样品间等量的总RNA(0.50 μg)经DNA酶处理后，采用PrimeScriptTMRT试剂盒合成cDNA，合成的cDNA经NanoDrop ND-2000(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)检测后，均稀释为100 ng/μl。采用SYBR Premix ExTaqTMII试剂盒在ABI7500(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)荧光定量PCR仪上进行反应，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GADPH)基因为内参基因。样本和内参分别设置3个重复，采用2-ΔΔCT法计算基因表达水平[14]。

2 结果与分析

2.1 目的基因cDNA全长克隆

以已经克隆的宁州2号SMT的cDNA为模板设计引物，克隆到另4个茶树品种该基因的cDNA全长，进一步BLASTx比对，最终得到5个茶树品种的目的基因ORF全长及其编码的氨基酸序列全长(图1，表1)。

2.2 SMT编码区核苷酸多态性

经核苷酸序列比对，发现5个茶树品种的ORF一致性为99.22 %，检测到19个核苷酸多态性位点，平均约每55 bp检测到1个SNP。在所检测出的17个SNPs中，有10个转换(T↔C，A↔G)和8个颠换(A↔C，A↔T，C↔G，G↔T)，转换与颠换比为1.25∶1，说明碱基突变的主要类型是转换(图2)。检测到2个InDels，一个位于35 bP，是大小为6 bp(TTCGTC和GTCGTC)或3 bp(GTC)的插入片段；1个位于FudingdabaichaSMT的第1050 bp，缺失3 bp(AAA)片段(图2)。

图1 目的基因cDNA的扩增结果Fig.1 Amplification of target gene cDNA

目的基因TargetgenesORF扩增后全长(bp)LengthaftercoloneofORFORF全长(bp)ORFlength氨基酸长Lengthaminoacid福鼎大白茶SMTFudingdabaichaSMT11281053350aa贵定鸟王茶SMTGuidingniaowangchaSMT11221050349aa龙井43SMTLongjinNo．43SMT11941053350aa宁州2号SMTNingzhouNo．2SMT12771050349aa祁门种SMTQimenzhongSMT12491056351aa

图2 5个茶树品种的CsSMT开放阅读框序列Fig.2 The open reading frame alignment of CsSMT gene in five tea cultivars

图3 5个茶树品种CsSMT编码氨基酸序列的比对Fig.3 Protein sequence alignment of CsSMT gene in five tea cultivars

图4 茶树CsSMT与其他植物同源蛋白的进化树Fig.4 Phylogenetic relationship of CsSMT in tea plant with the homologous proteins from other plants

2.3 SMT氨基酸多态性及系统发育树

5个茶树品种SMT的氨基酸序列一致性为99.15 %，检测到8个氨基酸单变异位点(I↔M，I↔L，F↔L，Q↔P，L↔V，A↔D，Q↔R，Y↔C)(图3)。福鼎大白茶SMT有5个位点(I→M，L→I，V→L，R→Q，C→Y)不同于其余4个品种；变异位点(F→L)和(Q→P)分别仅存在于宁州2号和龙井43(图3)。检测到1个氨基酸插入位点，福鼎大白茶和祁门种SMT序列插入了2个丝氨酸(S)，龙井43的SMT序列插入了1个S(图3)。

基于氨基酸序列同源性，采用非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育进化树(图4)，5个茶树品种的SMT聚为1大类，包含3小类，龙井43与福鼎大白茶SMT的亲缘关系较近，贵定鸟王茶与宁州2号的亲缘关系较近，祁门种单独聚为1小类。5个茶树品种的SMT与毛果杨(Populustrichocarpa)、野生大豆(Glycinesoja)、黄芪(Astragalusbisulcatus)、花菜(Brassicaoleracea)的SMT及川桑(Morusnotabilis)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿Medicagotruncatula)、毛果杨的HMTs(Homocysteine S-methyltransferase, HMT)亲缘关系较近(图4)。

2.4 不同硒浓度下茶树SMT表达模式

如图5所示，随着硒浓度的增加，龙井43幼苗成熟叶的SMT表达水平显著增加，而须根中的SMT表达水平显著降低。当硒浓度为5、10和20 mg/L时，成熟叶SMT的表达水平分别约为对照(0 mg/L)的1.3、1.4和1.5倍，而须根SMT的表达水平分别约为对照的0.9、0.7和0.6倍。

3 讨 论

SMT作为一些植物的富硒关键调控酶基因，已在一些富硒植物如黄芪[15]、花菜[16]和茶树[17]中克隆初步验证了该基因。还通过转黄芪AbSMT至拟南芥[18]及烟草(Nicotianatabacum)[19]，使宿主硒累积量增加。然而，有关同一作物，不同栽培品种间该基因多态性、组织表达差异等研究不多。

图5 不同硒浓度下龙井43的SMT表达模式Fig.5 Expression pattern of SMT genes in C.sinensis cv. Longjin43 under different selenium content

本研究发现，5个茶树品种间的SMT存在17个SNPs和2个InDels，引起8个氨基酸单变异位点和1个氨基酸插入位点，这9个氨基酸位点的变化有可能引起SMT的活性改变。前期已有研究发现这个氨基酸插入位点为SMT的丝氨酸磷酸化位点(待发表)，该磷酸化位点的增多或减少有可能引起该酶活性变化。8个氨基酸单变异位点中包含1个酪氨酸(Tyr, Y)突变位点，也是1个潜在的磷酸化位点。其他突变位点也可能引起该酶亲水性/疏水性、跨膜结构域、信号肽等性质改变，改变该酶功能，进而影响茶树对硒的富集能力。已研究发现茶树查尔酮合成酶CsCHS1、CsCHS2及茶树咖啡碱合成酶基因TCS1的点突变可分别改变茶叶多酚、咖啡碱含量[7-8]。此外，系统发育分析也发现，5个茶树品种间的SMT出现一定的遗传分化，进一步表明这些突变位点中存在与茶树叶片富硒相关的潜在位点。

王昌全[20]通过水培研究认为，硒浓度< 8 mg/L为中低硒浓度，促进蒙山9号(2年生)生长和发育，硒浓度> 8 mg/L则抑制生长。黄进[21]对多个茶树品种水培研究发现，在一定硒浓度范围内，随着硒浓度增加，硒敏感型茶树品种龙井43和乌牛早叶片硒累积量增加了20 %。也有研究表明，硒敏感型茶树品种根和叶SMT的表达水平高于非敏感型茶树品种[22]。本研究发现，随着硒浓度增加，茶树须根中SMT表达下降，而叶片中SMT表达上升，可能是硒浓度的增加抑制了须根生长，茶树为了解除硒毒害，把硒富集到叶片，转换成非蛋白质氨基酸，进而挥发至空气中。

本次仅初步研究了5个茶树品种该基因的多态性及其表达特性，研究的茶树品种有限，也未研究该基因在嫩叶中的表达，以及该基因的多态性与硒富集量的相关性，如何确定适宜茶园生产的硒浓度范围(即可促进茶树生长、提高品质，又达到富集硒的功能)，以及快速筛选富硒茶树品种等还有待进一步研究。

[1]Ellis D R, Salt D E. Plants,selenium and human health[J]. Current opinion in plant biology, 2003, 6(3):273-279.

[2]Weeks B S，Hanna M S，Cooperstein D. Dietary selenium and selenoprotein function[J]. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research,2012,18(8):127-132.

[3]Lyons G H, Genc Y, Soole K, et al. Selenium increases seed production inBrassica[J]. Plant Soil, 2009, 318: 73-80.

[4]刘声传，鄢东海，魏 杰. 茶树硒代半胱氨酸甲基转移酶基因生物信息学分析[J]. 西南农业学报, 2013, 26(6): 2221-2226.

[5]于 振, 李建科, 黄瑞蕊, 等. 陕西汉阴茶园土壤硒含量及茶叶硒富集能力[J]. 食品科学技术学报, 2013, 31(4): 15-18.

[6]Pilon-Smits E A H, Quinn C F. Selenium metabolism in plants[A]//Cell biology of metals and nutrients[M]. Springer Berlin Heidelberg, 2010: 225-241.

[8]张丽群, 韦 康, 王丽鸳, 等. 茶树CHS基因结构及编码区单核苷酸多态性分析[J]. 中国农业科学, 2014,47(1):133-144.

[9]魏艳丽. 茶树AMP脱氨酶基因的克隆及咖啡碱合成酶基因(TCSl)的cSNP分析[D]. 合肥：安徽农业大学, 2013:29-35.

[10]朱彩梅, 张 京.大麦糯性相关基因Wx单核苷酸多态性分析[J]. 中国农业科学, 2010,43(5):889-898.

[11]Zhu L, Jiang C J, Deng W W, et al. Cloning and expression of selenocysteine methyltransferase cDNA fromCamelliasinensis[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2008, 30(2): 167-174.

[12]刘声传. 茶树对干旱胁迫和复水响应的生理、分子机理[D].中国农业科学院, 2015:47-53.

[13]蔡荟梅, 彭传燚, 李成林, 等. 三个品种茶树氟富集特性及其在亚细胞中的分布[J]. 中国农业科学, 2013,46(8):1668-1675.

[14]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods, 2001, 25(4):402-408.

[15]Neuhierl B, Thanbichler M, Lottspeich F, et al. A family of Smethylmethionine dependent thiol/selenol methyltransferases: Role in selenium tolerance and evolutionary relation[J]. Journal of Biological Chemistry, 1999, 274(9): 5407-5414.

[16]Lyi S M, Heller L I, Rutzke M, et al. Molecular and biochemical characterization of the selenocysteine Se-methyltransferase gene and Se-methylselenocysteine synthesis in broccoli[J]. Plant Physiology, 2005, 138(1): 409-420.

[17]Zhu L, Jiang C J, Deng W W, et al. Cloning and expression of selenocysteine methyltransferase cDNA fromCamelliasinensis[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2008, 30(2): 167-174.

[18]Ellis D R, Sors T G, Brunk D G, et al. Production of Se-methylselenocysteine in transgenic plants expressing selenocysteine methyltransferase[J]. BMC Plant Biology, 2004, 4(1): 1-6.

[19]McKenzie M J, Hunter D A, Pathirana R, et al. Accumulation of an organic anticancer selenium compound in a transgenicSolanaceousspecies shows wider applicability of the selenocysteine methyltransferase transgene from selenium hyperaccumulators[J]. Transgenic Research, 2009, 18(3): 407-424.

[20]王昌全.水培条件下硒锌交互的茶树营养效应研究[D]. 成都：四川农业大学, 2007:23-49.

[21]黄 进. 硒对茶树抗氧化系统的影响及其在品种间富集特性研究[D]. 武汉：华中农业大学, 2014: 39-45.

[22]Tao S Q, Li J, Gu X G, et al. Quantitative analysis of ATP sulfurylase and selenocysteine methyltransferase gene expression in different organs of tea plant (Camelliasinensis)[J]. American Journal of Plant Sciences, 2011(3): 51-59.

(责任编辑 聂克艳)

Single Nucleotide Polymorphism and Expression Analysis ofCsSMTGene in Tea Plant

LIU Sheng-chuan, YAN Dong-hai, ZHOU Xue, MO Xue, HU Yi-ran, WEI Jie, ZHOU Fu-yu, ZHOU Yu-feng*

(Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultrural Sciences, Guizhou Guiyang 550006, China)

The present study was conducted to explore the selenocysteine methyltransferase (SMT) geneCsSMT, which played an essential role in tea plant leaves enriching selenium. The whole cDNA was obtained by RACE cloning. Based on solution culture experiments, expression patterns ofCsSMTin Longjin 43 were analyzed. Results: Through cloning the wholeCsSMTcDNA in five tea cultivars, their open reading frame (ORF) was obtained. By polymorphism identification ofSMTgene ORF for the five tea cultivars, 19 polymorphism sites were identified, including 17 single nucleotide polymorphisms (SNPs) and two InDels (insertion and deletion) with the polymorphism frequency of 1/55 bp. These polymorphism sites caused nine amino acid positions change. Amino acid sequence identification of SMT was 99.15 % in five tea cultivars, with a certain genetic distribution. Solution culture and the real-time PCR analysis showed thatCsSMTtranscripts in mature leaves were significantly increased upon the treatment of Na2SeO3, while the opposite trend was observed in fibrous roots.

Tea plant; Selenium;CsSMT; Nucleotide polymorphism; Expression pattern

1001-4829(2016)08-1793-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.007

2015-12-21

贵州省农业科学院研究生科研创新基金项目“茶树富硒作用关键酶基因CsSMT的克隆与超表达研究”[黔农科合(创新基金)2011006]；贵州省体改项目“现代高效农业园区茶叶栽培与加工技术集成示范”[黔科合Z字(2013)4008]；贵州省科研机构服务行动计划项目“黔茶系列茶树品种推广应用园区能力建设” [黔科合服企(2014)4008]，贵州省农业动植物育种专项“黔茶1号区域适应性高效栽培研究与示范”[黔农育专字(2012)022]，“贵定鸟王种扩繁和栽培技术集成与示范” [黔农育专字(2015)003]

刘声传(1981-)，男，副研究员，博士，从事茶树资源与分子生物学研究，E-mail: gtscliu@sohu.com，*为通讯作者。

S571.1

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