APP下载

青藤碱关节腔注射对膝骨关节炎兔软骨和滑膜组织形态学及基质金属蛋白酶-13和软骨寡聚基质蛋白的影响

2016-12-19郑洁王瑞辉寇久社

中国中医药信息杂志 2016年1期
关键词:碱组青藤透明质

郑洁,王瑞辉,寇久社

1.陕西中医药大学针灸推拿学院,陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学第二附属医院,陕西 咸阳 712046

青藤碱关节腔注射对膝骨关节炎兔软骨和滑膜组织形态学及基质金属蛋白酶-13和软骨寡聚基质蛋白的影响

郑洁1,王瑞辉1,寇久社2

1.陕西中医药大学针灸推拿学院,陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学第二附属医院,陕西 咸阳 712046

目的 观察青藤碱关节腔注射对膝骨关节炎模型兔关节软骨和滑膜组织形态学及血清和关节液中基质金属蛋白酶(MMP)-13和软骨寡聚基质蛋白(COMP)含量的影响,探讨青藤碱治疗膝骨关节炎的部分作用机制。方法 38只新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、透明质酸钠组和青藤碱组。空白组不予任何处理,模型组、透明质酸钠组和青藤碱组通过木瓜蛋白酶关节腔注射法诱导膝骨关节炎模型后,分别用生理盐水、透明质酸钠和青藤碱干预。5周后取关节软骨及滑膜HE染色并进行组织学评分,ELISA检测血清及关节液中MMP-13和COMP的含量。结果 模型组软骨Mankin's评分和滑膜组织病理学评分显著高于空白组,青藤碱组软骨Mankin's评分和滑膜组织病理学评分显著低于模型组(P<0.01);模型组血清及关节液中MMP-13和COMP含量较空白组显著升高(P<0.01);青藤碱组血清、关节液中MMP-13含量较模型组显著降低,关节液中COMP含量较模型组降低(P<0.05,P<0.01)。结论 青藤碱具有改善滑膜炎症、延缓关节软骨退变进程的作用。

青藤碱;骨关节炎;形态学;基质金属蛋白酶-13;软骨寡聚基质蛋白;兔

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一类以关节软骨细胞外基质进行性破坏为特点,并伴有滑膜、软骨下骨及关节周围组织病变的复杂性关节疾病。由于病理机制不明确,目前无有效方法可完全阻止OA的病理进程。青藤碱是从中药青风藤中提取的一种生物碱,具有镇痛、抗炎、调节免疫、降血压、抗心律失常等药理作用[1]。青藤碱在骨关节病中的临床及实验研究目前仍主要集中在类风湿关节炎,而应用于OA的研究较少。本实验通过观察盐酸青藤碱关节腔注射对膝骨关节炎模型兔软骨及滑膜形态学的影响,并检测血清及关节液中基质金属蛋白酶(MMP)-13和软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)的含量,探讨青藤碱治疗膝骨关节炎的部分作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

新西兰大白兔40只,4~6月龄,雌雄各半,体质量1.8~2.2 kg,西安交通大学医学院实验动物中心,合格证号SCXK(陕)2008-008。单笼、标准饲料喂养,室温20~25 ℃,相对湿度45%~60%,每日正常光照,空气流通,自由摄食、饮水。

1.2 药物

MMP-13、COMP ELISA试剂盒(北京诺博莱科技有限公司),正清风痛宁注射液(主要成分盐酸青藤碱),湖南正清制药集团股份有限公司,批号1304402-003;玻璃酸钠注射液,山东博士伦福瑞达制药有限公司,批号130308011。

1.3 主要试剂与仪器

木瓜蛋白酶,Merck公司,货号107147。超薄切片机(德国LEICA公司),ELX808型酶标仪(美国Bio-Tec公司)。

2 实验方法

2.1 造模、分组及干预

40只兔先分为空白组(8只)和造模组(32只),采用木瓜蛋白酶注射法造模。造模组于实验第1、4、7日兔右膝关节腔注射4%(20 mg)木瓜蛋白酶溶液0.5 mL,首次注射4周后随机处死2只兔,病理学观察出现典型软骨退变表现,同时兔出现右膝关节肿胀、跛行,表明造模成功。造模组再随机分为模型组、透明质酸钠组和青藤碱组,每组10只。根据成人用药剂量(透明质酸钠和青藤碱均为2 mL/次)按Meeh-Rubner公式计算人兔等效剂量。除空白组外,各组兔造模侧膝关节行关节腔注射,青藤碱组膝关节腔注射盐酸青藤碱注射液0.2 mL(5 mg),每3 d注射1次,共给药10次;透明质酸钠组膝关节腔注射透明质酸钠注射液0.2 mL,每6 d注射1次,共给药5次;模型组膝关节腔注射生理盐水0.2 mL,注射次数同青藤碱组。干预时间共计30 d。实验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

2.2 取材及标本处理

2.2.1 关节液采集 干预结束后,生理盐水冲洗收集关节液。于兔右膝关节腔内注入生理盐水1 mL,充分活动膝关节使生理盐水与关节液充分混合,再抽取关节腔内生理盐水0.6~1 mL至EP管,4000 r/min离心10 min,取上清液,-80 ℃保存备检。

2.2.2 滑膜采集 关节液标本采集完毕后,耳源静脉空气栓塞法处死全部实验动物。采用髌旁内外并横断骸韧带的联合切口,将软组织瓣包括髌骨一起向上翻起,并极度屈膝以充分显露膝关节腔,肉眼观察滑膜、软骨等大体情况并记录,取右膝髌骨下滑膜组织,以冰生理盐水冲洗后置10%中性甲醛中固定48 h,石蜡包埋,常规切片备用。

2.3 软骨组织形态学观察及评分

造模侧内侧胫骨平台标本HE染色。光学显微镜下观察软骨组织结构,每张切片选择3个不同的视野,并参照Mankin's关节软骨病理评分标准[2]进行评分并统计。评分标准见表1。

表1 骨性关节炎软骨组织病理学分级评分(Mankin's)标准

2.4 滑膜组织形态学观察

造模侧髌骨下滑膜标本HE染色。每张切片选择3个不同的视野,对滑膜里衬层细胞及滑膜下组织进行观察并评分。滑膜里衬层细胞观察内容为增生、肥大和炎细胞浸润,滑膜下组织观察内容为肉芽组织增生、血管组织长入和炎细胞浸润,评分标准均按无、轻、中和重分别计0、1、2、3分[3]。

2.5 基质金属蛋白酶-13、软骨寡聚基质蛋白含量测定

ELISA检测血清和关节液中MMP-13和COMP的含量,严格按着试剂盒说明进行操作。

3 统计学方法

4 结果

4.1 一般情况

实验过程中,模型组、透明质酸钠组和青藤碱组各死亡1只兔,最终共35只兔进入实验。各组兔精神状态良好,进食正常,体质量均有所增加,以模型组最为明显。木瓜蛋白酶注射后,所有造模组兔均出现明显的患膝肿胀,膝关节主、被动活动范围下降,行走时患腿负重减少,盐酸青藤碱和透明质酸钠干预后以上症状、体征明显改善。

4.2 软骨大体观察

软骨肉眼观察发现,各组兔内侧胫骨平台磨损均明显重于股骨内髁,可能与兔膝关节受力机制有关。空白组关节软骨表面呈浅蓝白色,光滑而有光泽,无糜烂,有一定弹性;模型组关节软骨表面粗糙,色泽变暗,伴有裂纹、糜烂,部分软骨下骨质暴露;透明质酸钠组关节软骨表面欠光滑,部分可见裂纹,尚未见软骨下骨质暴露;青藤碱组关节软骨略粗糙,糜烂程度较透明质酸钠组轻。

4.3 软骨病理观察结果

空白组关节软骨结构层次清晰,表层完整光滑,染色均匀,软骨分布均匀;模型组软骨塌陷,层次严重紊乱,细胞显著减少,潮线无法辨清;透明质酸钠组软骨表面不完整,出现多处裂隙达放射深层,病变局部软骨细胞增多,潮线完整,病理变化较模型组有所减轻;青藤碱组软骨层次清晰可辨,部分裂隙达放射浅层,细胞弥漫性增多,潮线完整。结果见图1。

图1 各组兔软骨切片HE染色(×400)

4.4 软骨组织病理评分结果

模型组Mankin's评分高于其他3组,青藤碱组与透明质酸钠组评分比较差异无统计学意义,提示青藤碱与透明质酸钠均能不同程度延缓OA软骨退变进程,对OA软骨具有保护作用。结果见表2。

表2 各组兔软骨Mankin's评分比较(±s)

表2 各组兔软骨Mankin's评分比较(±s)

注:与空白组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01(下同)

组别 只数 分值空白组 8 1.60±0.55模型组 9 9.00±0.71**透明质酸钠组 9 5.80±0.84**##青藤碱组 9 6.20±0.45**##

4.5 滑膜组织形态学观察及评分

肉眼观察显示,空白组滑膜未见明显改变;模型组滑膜充血肿胀,关节液较其他各组明显增多,颜色发黄、质稠;透明质酸钠组滑膜轻度肿胀,关节液较空白组有所增加;青藤碱组滑膜稍有肿胀,关节液较为清亮,量明显少于模型组和透明质酸钠组,见图2。空白组无炎性细胞,滑膜薄而细胞数少;模型组滑膜明显增厚,全层均有显著炎细胞浸润,滑膜下层有肉芽组织生成,并可见淋巴管形成;透明质酸钠组滑膜里衬层稍增厚,滑膜细胞轻度肥大,并有显著炎细胞浸润;青藤碱组仅里衬层稍有炎细胞浸润。模型组滑膜评分显著高于其他3组(P<0.01);青藤碱组评分明显低于透明质酸钠组(P<0.05),与空白组比较差异无统计学意义。结果见表3。

图2 各组兔滑膜组织HE染色(×200)

表3 各组兔滑膜组织形态学评分比较(s)

表3 各组兔滑膜组织形态学评分比较(s)

注:与透明质酸钠组比较,△P<0.05

组别 只数 分值空白组 8 0.80±0.84模型组 9 9.60±0.90**透明质酸钠组 9 4.40±1.14**##青藤碱组 9 2.00±0.71##△

4.6 青藤碱对兔血清及关节液基质金属蛋白酶-13、软骨寡聚基质蛋白含量的影响

模型组、青藤碱组和透明质酸钠组血清及关节液中MMP-13水平较空白组显著升高(P<0.01),但青藤碱组和透明质酸钠组低于模型组(P<0.05,P<0.01),青藤碱组血清及关节液中MMP-13水平略高于透明质酸钠组,但差异无统计学意义(P>0.05)。各组血清COMP水平均无明显差异。模型组关节液COMP水平较空白组显著升高(P<0.01);青藤碱组和透明质酸钠组关节液COMP水平显著低于模型组(P<0.01)。结果见表4。

组别 只数 MMP-13 COMP血清 关节液 血清 关节液空白组 8 22.28±1.42 24.23±2.32 0.87±0.09 0.91±0.72模型组 9 28.79±2.26**31.25±2.43**0.89±0.65 1.19±0.12**透明质酸钠组 9 24.97±1.48**#28.53±1.80**##0.87±0.12 1.04±0.12##青藤碱组 9 25.27±1.50**#28.67±2.38**##0.92±0.11 1.04±0.10##

5 讨论

关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成。细胞基质的主要成分是蛋白多糖和胶原,其中Ⅱ型胶原是软骨主要的胶原成分,占软骨干重60%,维持着软骨的生物力学性能。MMPs是一组能够降解细胞外基质的内肽酶,在OA软骨基质降解期发挥重要作用[4]。其中MMP-13是Ⅱ型胶原最有效的降解酶,文献报道,MMP-13在OA软骨细胞及滑膜组织均呈高表达[5],OA患者患膝关节液MMP-13水平显著升高[6]。研究发现,MMP-13基因缺陷可抑制抗体诱导的C57 OA小鼠关节局部炎性反应,对软骨具有保护作用,提示除了对软骨基质的降解作用,MMP-13还可通过促进炎性反应加速OA软骨退变进程[7]。COMP是关节软骨细胞外基质的一种大分子,属于凝血栓蛋白家族,其具体功能目前还不十分明确。有研究发现,通过与胶原纤维及细胞外基质成分相互作用,COMP在软骨内骨化及维持细胞外基质稳定中发挥了重要作用[8]。COMP通过促进胶原分子早期关联进而加快原纤维合成,影响Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的形成;COMP还可与蛋白聚糖结合,维持软骨基质稳态[8]。OA患者血清及关节液中COMP水平显著升高[9-10],因此,COMP被认为是OA关节软骨破坏的生物学标志物。

青风藤为防己科藤本植物青藤的藤茎,性味辛、苦、温,入肝、脾经,具有祛风湿、通经络等功效。青藤碱是青风藤的主要活性成分。文献报道,青藤碱膝关节腔注射可降低关节液中炎性因子含量,延缓软骨退变进程,提示青藤碱对OA软骨具有保护作用,其机制可能与其抗炎作用有关[11-13]。本实验病理学观察显示,青藤碱关节腔注射后Mankin's评分及滑膜评分均明显降低;ELISA检测发现,青藤碱关节腔注射可降低关节液MMP-13和COMP水平。

综上表明,青藤碱膝关节腔注射对OA关节软骨具有保护作用,其机制可能与抑制滑膜炎性反应、降低MMP-13表达有关。

[1] 季宇彬.中药有效成分药理与应用[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1995:427.

[2] MANKIN H J, DORFMAN H, LIPPIELLO L, et al. Biochemical and metabolicabnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips.Ⅱ.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data[J]. Bone Joint Surg,1971,53(3):523-531.

[3] PRITZKER K P, GAY S, JIMENE Z S A, et al. Osteoarthritis cartilage histopathology:grading and staging[J]. Osteoarthritis Cartilage,2006,14(1):13-29.

[4] RONG Z, CHENG L, REN Y, et al. Interleukin-17F signaling requires ubiquitination of interleukin-17 receptor viaTRAF6[J]. Cell Signal,2007,19(7):1514-1520.

[5] LU J, SUN Y, GE Q, et al. Histone deacetylase 4 alters cartilage homeostasis in human osteoarthritis[J]. BMC Musculoskelet Disord,2014,15(12):438.

[6] 侯亚平.膝骨关节炎患者滑液中炎症因子的表达及其与中医证型的相关性分析[J].湖南中医药大学学报,2014,34(4):29-31.

[7] SINGH A, RAJASEKARAN N, HARTENSTEIN B, et al. Collagenase-3 (MMP-13) deficiency protects C57BL/6 mice from antibody-induced arthritis[J]. Arthritis Research & Therapy,2013,15(6):R222. [8] HALASZ K, KASSNER A, MORGELIN M, et al. COMP acts as a catalyst in collagen fibrillogenesis[J]. J Biol Chem,2007,282(43):31166-31173.

[9] 李恒,王丹,武中庆,等.血清COMP在骨关节炎早期诊断中的作用[J].中国骨伤,2012,25(5):380-383.

[10] 王晓滨,薛庆云.骨关节炎患者滑液中COMP水平与病情严重程度的相关性研究[J].中国骨与关节外科,2012,5(1):60-64.

[11] 杨惠琴,陈礼荣.青藤碱对膝骨性关节炎实验兔关节液及血清白细胞介素-1β含量的影响[J].中西医结合学报,2008,6(12):1275-1279.[12] 杨惠琴,陈礼荣.青藤碱对膝骨性关节炎实验兔关节液及血清中TNF-α水平的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2008,30(7):448-450.

[13] 吴红娟,孙必强,朱传湘,等.盐酸青藤碱对家兔骨关节炎关节液IL-1β、PGE2生成与关节组织结构的影响[J].湖南中医药大学学报, 2010,30(9):84-86.

Effects of Intra-articular Injection of Sinomenine on Morphology, MMP-13 Level and Cartilage Oligomeric Matrix Protein of Rabbit Knee Osteoarthritis Model


ZHENG Jie1,

WANG Rui-hui1, KOU Jiu-she2(1. College of Acupunture and Moxibustion, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China; 2. Second Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

Objective To observe the effects of intra-articular injection of sinomenine on morphology of synovium and cartilage as well as contents of MMP-13 and cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model. Methods A total of 38 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups: control group, model group, hyaluronate group and sinomenine group. Model group, hyaluronate group and sinomenine group established knee osteoarthritis model by intra-articular injection of papain enzyme, and were treated with saline, sodium hyaluronate and sinomenine respectively except for control group. 5 weeks after treatment, all rabbits were sacrificed for HE staining and histological grading on cartilago articularis and synovium, and ELISA method was used to detect the contents of MMP-13 and COMP in rabbit serum and synovial fluid. Results Mankin's scores of articular cartilage and histological scores of synovium in model group were significantly higher than those of control group (P<0.01), and were markedly lower in sinomenine group than those of model group (P<0.01); the contents of MMP-13 and COMP in serum and synovial fluid of model group were significantly raised compared with control group (P<0.01), and were reduced obviously in sinomenine group compared with model group (P<0.05, P<0.01). Conclusion Intra-articular injection of sinomenine can reduce the levels of MMP-13 and COMP in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis model, and improve synovial inflammation, as well as delay the degradation of articular cartilage.

sinomenine; osteoarthritis; morphology; MMP-13; cartilage oligomeric matrix protein; rabbits

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.017

R285.5

A

1005-5304(2016)01-0074-04

2015-04-27)

(

2015-10-19;编辑:华强)

陕西省教育厅科学研究项目(14JK1209);陕西省中医康复学重点学科建设项目(2011年);陕西中医学院创新基金培育项目(14XJZR27)

猜你喜欢

碱组青藤透明质
透明质酸衍生物的研究进展
小檗碱对肝硬化大鼠肝功能的保护及炎症抑制作用
透明质酸基纳米纤维促进创面愈合
盐酸小檗碱对宫颈癌HeLa细胞外泌体的影响及其机制
知是荷香慢墨香 从「青藤白阳」到海上画派
青藤碱对骨肉瘤细胞增殖的影响及其抑瘤作用观察
三叶青藤正丁醇部位化学成分的研究
青藤欢笑
透明质酸水凝胶的制备与评价
肉毒素和透明质酸联合治疗眉间纹疗效分析