安 亮, 苏 燕

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头医学院第三附属医院检验科)



人类红细胞蛋白质组学研究进展*

安 亮1，2, 苏 燕1

(1.包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头 014060；2.包头医学院第三附属医院检验科)

20世纪末人类基因组计划将生物医学研究推入了“组学”研究的时代，蛋白质组学无疑是最核心的部分。蛋白质组学包括蛋白质的定位、结构和功能、蛋白质相互作用以及特定时空的蛋白质表达谱等。红细胞(red blood cell，RBC)是血液中数量最多的血细胞，起着运送氧、二氧化碳等的重要功能。相对于其它细胞，红细胞易获得、易纯化、结构相对简单的特点使它成为蛋白质组学研究的最佳选择[1]，也是不久的将来最有可能完成完整蛋白质组学分析的细胞。在过去的十几年中，随着质谱和生物信息学的迅速发展，红细胞蛋白质组学的研究取得了一系列的进展。

1 红细胞的蛋白组成

红细胞发源于骨髓造血干细胞，由于没有细胞核和内膜系统，红细胞内的蛋白主要分为膜蛋白、膜骨架及胞浆蛋白。膜蛋白分为内在蛋白和外周蛋白以及脂锚定蛋白；膜骨架蛋白是细胞膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网状结构，参与维持质膜性状并协助完成其多种生理功能；胞浆蛋白主要为血红蛋白(hemoglobin，Hb)，其次还含有碳酸酐酶、硫氧还蛋白过氧化物酶和其它抗氧化酶。

2 红细胞蛋白质组学的研究进展

研究红细胞蛋白质组学，需要了解红细胞中每种蛋白质的氨基酸序列、转录后修饰以及每个细胞内蛋白质含量及蛋白间的相互作用。现代质谱技术和生物信息学的应用，使人们对红细胞蛋白质组学有了深层次的认识。2002年之前人们对红细胞蛋白质组学的研究并未全面展开，尔后随着这一领域相关研究技术的进展，红细胞蛋白质组学的研究紧密跟进。2002年，Low等首次使用双向电泳分离红细胞膜蛋白，银染后用MALDI-TOF质谱鉴定出84种膜蛋白。之后，Kakhniashvili等利用经典的RBC分离技术，联合Shotgun蛋白质组学分析方法和ThermoFinnigen LCQ DECA XP离子阱串联质谱鉴定了RBC中181种膜蛋白和胞浆蛋白，其中包括血型糖蛋白A和C及只有几百拷贝数的其他蛋白(如基细胞黏连分子B-CAM)。Neelam等[2]利用免疫共荧光和蛋白质免疫印迹证明，RBC中存在蛋白酶体亚型和完整的蛋白酶体，打破之前RBC中没有蛋白酶体降解蛋白的研究报道。2006年底，Pasina等[3]利用四极杆-飞行时间串联质谱和Thermo热电混合线性离子阱傅里叶变换质谱鉴定出RBC内566种蛋白质，包括314种膜蛋白和252种可溶性蛋白质。同时，Pasini等用乙醇和碳酸钠优化膜蛋白提取方法，对蛋白质鉴定产生实质性技术上的贡献。至此，忽略转录后修饰和蛋白水解，共鉴定出751种RBC蛋白质。随着肽配体库和质谱技术的发展，2008年，Roux-Dalvai等[4]通过快速和高通量Electron LTQ Orbitrap质谱成功鉴定出1578种RBC胞质蛋白。2010年，Proteominer技术的应用使红细胞蛋白质数量增加1 331种，达到2 082种[5]。2010年至今，红细胞蛋白质组学的进展主要集中在膜蛋白领域。van Gestel等[6]用双向蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术从524种膜蛋白中鉴定出其中67种是胞浆蛋白。最近，这项技术被拓展为四维正交凝胶系统。该系统由非变性电泳部分及变性电泳部分组成。通过非变性电泳对RBC及Raji细胞胞质蛋白的分离并结合SDS-PAGE和质谱分析，确定了六种蛋白质复合体，即蛋白酶体20S核心复合体、HbA、HbA2、过氧化物氧化酶-2(peroxiredoxin-2，Prx2)、碳酸酐酶-1(carbonic anhydrase-1，CA1)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)复合体。从中选择四种具有不同分子量和等电点的复合体：CP、HbA、Prx2及HSP60进行变性电泳蛋白质组学分析，结果表明，4-DES不仅适用于复杂生物样品中的蛋白质复合体及蛋白质相互作用的研究，而且可用于复杂稀释样品中完整蛋白质复合体的分离富集[7]。De Palma等[8]将完整RBC用胰蛋白酶消化后分离膜蛋白，将其用Triton X-100溶解后分离可溶部分和膜骨架，将二者再用胰蛋白酶消化，用MudPIT技术和线性离子阱LTQ质谱对这三部分进行蛋白鉴定。结果显示，确定的299种蛋白中211种是膜蛋白。Speicher等[9]用SDS-PAGE分离红细胞膜蛋白后将凝胶分成30等份，之后用LTQ-Orbitrap XL质谱分析鉴定了842种蛋白。创新性的方法的应用，使红细胞蛋白质总数从2010年的2082上升到2 289，仅增加了207种。因此，要鉴定所有的RBC蛋白质还有很长的路要走，这有待于更高灵敏度和准确性的质谱技术进一步发展。

3 红细胞蛋白相互作用的研究

蛋白质通过与其它物质(蛋白质，核酸，小分子等)相互作用而行使其功能，一旦这种有序的相互作用遭到破坏，就会导致疾病甚至死亡。因此，蛋白质与其它物质的相互作用成为人类疾病预防和治疗的重要对象，而蛋白质与蛋白质之间的相互作用又成为其中最关键的一部分。在高通量RBC及RBC膜蛋白质组数据获得后，关于RBC内蛋白质之间的相互作用主要是通过生物信息学进行预测。初步的红细胞相互作用分析是基于UniHI数据库[9，10]。Goodman等最初基于已发现的RBC内751种蛋白建立了RBC蛋白相互作用网络，并发现751种蛋白中有279种与其它蛋白之间存在相互作用。在对红细胞蛋白质相互作用的研究中重要的发现是“损伤和修复”盒，此盒主要由蛋白酶体亚基、伴侣分子、热休克蛋白组成，对红细胞的损伤修复至关重要。Ammann和Goodman[11]用称为广泛拓扑重叠分析的方法对节点的相似性进行统计学的聚类分析。运用这样的方法发现在镰刀形红细胞贫血中“损伤和修复”盒中的蛋白酶体亚基发生改变。这之后有学者提出了VDG的概念对红细胞蛋白质之间的相互作用进行分析，认为这是一种比聚类分析更快速的分析方法[12]。

4 疾病的红细胞蛋白质组学

早期对RBC蛋白质组学与疾病关系的研究是利用双向电泳来比较疾病组织与正常组织中的蛋白质含量。Jiang等[13]用这样的方法比较正常人群和2型糖尿患者之间膜蛋白的差异，在2型糖尿患者的膜蛋白中发现了27个上调点和15个下调点。经MALDI TOF质谱分析发现脂筏蛋白、Flotlin 1、精氨酸酶增加，突触融合蛋白1C减少。推测融合蛋白减少会导致2型糖尿病红细胞膜Glut 4糖尿病载体减少，推测由于精氨酸酶增加而与一氧化氮合酶竞争，从而减少一氧化氮产生。Tonge等[14]利用2D-DIGE研究纯合子镰状细胞疾病(sickle cell disease，SCD)时发现，SCD红细胞膜蛋白中有38个点增加，而纯合子SCD中有11个点增加。用Nano LC MS/MS串联质谱对44个点进行鉴定发现其中有22个有转录后修饰，而纯合子中的蛋白多数与氧化应激有关。Prabakaran等[15]用2D-DIGE对精神分裂患者的红细胞蛋白进行了研究。研究发现，Spectrinα和β-actin的改变可能会影响转录后修饰的改变，而硒绑定蛋白1可作为一种精神分裂症的生物标志物。最近对疾病与红细胞蛋白质组学的研究主要是利用蛋白质组学对疾病的分子基础、疾病进程等进行研究，疟疾、溶血性贫血、阿尔茨海默病、慢性肾病等红细胞膜蛋白组学的相关研究取得了一定的进展。

红细胞蛋白质组学的研究为我们提供大量的数据和信息，同时也为研究带来困扰。如何通过海量信息找寻隐藏其中的奥秘，需要我们在今后的研究中不断进行挖掘。

[1] Barasa B,Slijper M.Challenges for red blood cell biomarker discovery through proteomics[J].Biochimica et Biophysica Acta,2014,1844: 1003-1010.

[2] Steven RG,Ovidiu D,David G K,et al.The proteomics and interactomics of human erythrocytes[J].Experimental Biology and Mdeicine,2013, 238:509-518.

[3] Erica M,Pasini EM,Kirkegaard M,et al.In-deepth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells[J].Blood,2006, 108(3):791-801.

[4] Florence RD,Anne GP,Carolina S,et al.Extensive analysis of the cytoplasmic proteome of human erythrocytes using the peptide ligand library technology and advanced mass spectrometry[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(11):2254-2269.

[5] Angelo DA,Pier GR,Lello Z.The red blood cell protome and interactome: An update[J].J Proteome Res,2010,9(1):144-163.

[6] van Gestel RA,van Solinge WW,van der Toorn HWP,et al.Quantitative erythrocyte membrane proteome analysis with blue-Native /SDS PAGE[J].J Proteomics,2010,73(3):456-465.

[7] Wang X,Chen G,Liu H,et al.Four-dimensional orthogonal electrophoresis system for screening protein complexes and protein-protein interactions combined with mass spectrometry[J].J Proteomo Res,2010,9(10):5325-5334.

[8] De Palma A,Roveri A,Zaccarin M,et al.Extraction methods of red blood cell membrane proteins for multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis[J].J Chromatogr A,2010,1217(33): 5328-5336.

[9] Pesciotta EN,Sriswasdi S,Tang H,et al.A label-free proteome analysis strategy for identifying quantitative changes in erythrocyte membranes induced by red cell disorders[J].J Proteomics,2012,76(5):194-202.

[10] Chaurasia G,Iqbal,Fustchik M,et al.UniHI:an entry gate to the human protein interactome[J].Nucleic Acids Res.2007,35:D590-604.

[11] Ammann LP,Goodman SR.Cluster analysis for the impact of sickle cell disease on the human erythrocyte protein interactome[J].Exp Biol Med,2009,234(6):335-343.

[12] Zivanic M,Daescu O,Kurdia A,et al.The voronoi diagram for graphs and its application in the sickle cell disease research[J].J Comput Sci,2012,3(5):335-343.

[13] Jiang M,Jia L,Jiang W,et al.Protein disregulation in red blood cell membranes of type 2 diabetic patients[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003,309(1):196-200.

[14] Kakhniashvili DG,Griko NB,Bulla Jr,et al.The proteomics of sickle cell disease:Profiling of erythrocyte membrane proteins of sickle cell disease:Profiling of erythrocyte membrane proteins by 2D-DIGE and tandem mass spectrometry[J].Experimental Biology and Medicine, 2005,230(11):787-792.

[15] Prabakaran S,Wengenroth M,Lockstone HE.2-D DIGE analysis of liver and red blood cells provides funther evidence for oxidative stress in schizophrenia[J].Journal of Proteome Research,2007,6(1):141 -149.

国家自然科学基金(81160214)、内蒙古自然科学基金(2010BS1101)、内蒙古自治区卫生厅基金(2010056)和内蒙古自治区研究生教育创新项目(S201310127-Y02、S201410127-Y01)

苏 燕

2015-08-26)