殷　媛，王　成，戴　欣，黄朝晖

1.江南大学附属医院肿瘤研究所，江苏 无锡 214062；2.南京军区南京总医院检验科，江苏 南京 210002；3.美世大学药学院，制药科学系，癌症纳米医学实验室，佐治亚州 亚特兰大 30341

肠炎和肠炎相关结直肠癌miRNA表达检测及生物信息学分析

殷媛1，王成2，戴欣3，黄朝晖1

1.江南大学附属医院肿瘤研究所，江苏 无锡 214062；2.南京军区南京总医院检验科，江苏 南京 210002；3.美世大学药学院，制药科学系，癌症纳米医学实验室，佐治亚州 亚特兰大 30341

背景与目的：炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)为一组慢性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)与克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。肠炎相关性结直肠癌(colitis-associated colorectal cancers，CAC)是由IBD癌化形成的一种恶性肿瘤。该研究通过检测UC、CD和CAC组织中相关微小核糖核酸(miRNA)的水平，初步探讨其作为肠炎癌转化分子标志物的可能性，并对在肠炎和CAC中显著变化的一组miRNAs进行靶基因归集和生物信息学分析，为以miRNAs为靶点的基因治疗提供理论和实验基础。方法：采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)技术，检测13例UC组织、3例CD患者组织、12例CAC组织及8例正常肠组织中16种miRNAs的表达。通过生物信息学对显著变化的一组miRNA进行靶基因分析，将文献中已报导的所有靶基因进行汇总，并利用DAVID数据库对靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)和信号转导通路富集分析(KEGG-analysis，BIOCARTA-analysis)。结果：炎症相关miR-146a和癌症相关miR-27a、miR-29a、miR-20a、miR-21在UC、CD和CAC中的表达都显著高于正常结肠组织，且这一组miRNA的靶基因都富集在癌症相关通路、免疫信号相关通路和炎癌转换相关通路上。结论：miR-146a、miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21可能是参与肠炎向结直肠癌转化的一组miRNA。

微小核糖核酸；溃疡性结肠炎；克罗恩病；肠炎相关结直肠癌；实时荧光定量聚合酶链反应；GO分析；KEGG分析；BIOCARTA分析

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)为一组慢性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)与克罗恩病(Crohn’s disease，CD)［1-2］。IBD是一类病因不明的肠道慢性非特异性炎症，其诊断和治疗都相当棘手，现有治疗手段很难将其完全治愈。IBD的持续发作不仅严重影响患者的生活质量，而且可发生癌变，严重威胁患者的生命健康［3-4］。肠炎相关性结直肠癌(colitis-associated colorectal cancers，CAC)是由IBD癌化形成的一种恶性肿瘤，虽然占总体结直肠癌的比例不高(小于等于5%)，但恶性程度高，诊断时多为晚期，且呈多灶性、异质性特点，同时还常伴有其他部位肿瘤发生，如淋巴瘤、胆管癌等，因此其5年生存率明显低于结直肠癌平均值。有研究显示，18.4%的IBD患者会转化为CAC，但目前尚无有效的方法对此种并发症的发生进行检测，同时，IBD转化为CAC的分子机制目前并不清楚［5］。

微小核糖核酸(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，其在进化上高度保守，普遍存在于动植物体内。目前，已经证实人体内有超过30%的编码基因受到miRNA调控，因此miRNA广泛参与细胞的发育分化、能量代谢、细胞周期及纤维化的生理过程［6］。有研究显示，miRNA在癌症包括结肠癌的发生、发展过程中发挥重要作用，一些特异变化的miRNA被称为“原癌miRNA”，可以作为癌症发生、发展的标志物［7］。同时，有研究表明，结肠炎组织中miRNA表达与正常组织差异显著［8］。目前，关于CAC中miRNA表达报道较少，因此，对IBD组织及CAC组织中miRNA表达的检测和比较将会为炎症转化为癌症提供一种动态监测指标，同时也可为CAC的发生、发展的分子机制研究提供一条新的思路。

随着miRNA研究的日渐深入，对其功能进行筛选和验证需要更明确的指向性［9］。通过对miRNA靶基因进行生物学富集分析，可以为寻找miRNA表达谱改变所引起的生物学变化提供线索，以便进一步鉴定和筛选有意义的生物学功能。

本研究检测和分析了UC、CD和CAC组织中相关miRNA的水平，探讨其作为肠炎癌转化分子标志物的可能性。对其中显著变化的一组miRNAs靶基因进行生物学富集分析，为以miRNAs为靶点的基因治疗提供理论和实验基础。

1　　材料和方法

1.1标本来源

收集2010年2月—2012年10月在江南大学附属医院确诊的组织标本36例，包括UC组织13例，CD患者组织3例，CAC组织12例及正常对照组织8例，所有组织标本取出后立即置于液氮中速冻后，置-80 ℃环境中保存待用。

1.2主要仪器及试剂

7300型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，高速冷冻离心机购自美国Eppendorf公司，SAS67120型超纯水机购自美国Millipore公司，引物、反向互补探针购自美国ABI公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3组织RNA 提取

取100 μg组织，按TRIzol试剂说明书操作提取组织RNA。

1.4RTFQ-PCR检测

组织RNA逆转录反应总体系均为10 μL，包括DEPC处理的不含RNA酶H2O 3.5 μL，5×AMV逆转录酶缓冲液2 μL，dNTP 1 μL，逆转录引物1 μL，AMV酶0.5 μL，RNA 2 μL。反应参数：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃循环反应。RT F Q-P C R反应体系为20 μL，包括双蒸水14.77 μL，10×PCR缓冲液2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，Taq酶0.3 μL，探针0.33 μL，cDNA 1 μL。循环参数：95 ℃5 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，共40个循环。每个样本检测3个复孔。组织miRNA的含量采用相对定量法进行，以U6 snRNA为内参照，用2−△Ct计算，其中△Ct = CtmiRNA-CtU6。

1.5靶基因生物信息学分析

利用miRNA靶基因数据库miRWalk 2.0分别对文献中已证明过的miRNA靶基因进行查询和汇总，得到目标靶基因合集。

利用DAVID数据库对靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)，根据GO的3大应用功能(即分子功能、生物学过程和细胞组分)分析，得到这些靶基因主要参与的生物学过程。根据靶基因在功能集中的数量百分比计算富积得分，并计算显著性程度P值，P<0.001为阈值得到差异有统计学意义的功能富集。

利用DAVID数据库对靶基因进行信号转导通路富集分析(KEGG-analysis，BIOCARTA-analysis)，得到这些靶基因主要参与的信号通路。根据靶基因在功能集中的数量百分比计算富积得分，并计算显著性程度P值，P<0.001为阈值得到差异有统计学意义的信号转导通路富集。

1.6统计学处理

用GraphPad Prism 6软件进行数据统计分析。数据以进行，表示在分析前进行正态性检验。组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　　结果

2.1miRNA表达谱检测和分析

根据课题组前期芯片结果及文献报道结果［10-11］，本研究运用RTFQ-PCR技术对选取的包括炎症相关miRNAs(miR-146a、miR-146b、miR-150、miR-155、miR-193-3p和miR-181a)和原癌miRNAs(miR-27a、miR-29a、miR-210、miR-191、miR-194、miR-214、miR-20a、miR-21、miR-24和miR-30d)共16种miRNAs的表达水平进行了检测。

2.1.1炎症相关miRNAs在不同组织中的表达水平

本研究运用RTFQ-PCR技术对选取的炎症相关miRNAs的表达水平进行了检测。结果表明，miR-146a、miR-146b和miR-150在UC、CD和CAC中的表达与正常结肠组织相比都上升，且miR-146a的表达与正常肠组织相比差异有统计学意义(P<0.01)，并且CAC与UC相比，miR-146a的表达差异有统计学意义(P<0.01，图1)。

图1　炎症相关miRNAs在不同组织中的表达水平Fig. 1 Expression levels of inflammation associated miRNAs in different tissues

2.1.2癌症相关miRNA在不同组织中的表达水平

本研究运用RTFQ-PCR技术对选取的癌症相关miRNAs的表达水平进行了检测，结果见图2。结果表明，miR-27a、miR-29a、miR-214、miR-20a、miR-21和miR-24在UC、CD和CAC中的表达都上升，其中miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21的表达与正常肠组织相比，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，我们对IBD和CAC组织中的miRNA表达进行分析发现，miR-27a、miR-20a和miR-21在IBD和CAC之间差异有统计学意义(P<0.05)。而miR-29a的表达虽然在IBD和CAC之间差异无统计学意义，但其表达丰度高，与正常组织相比变化明显，因此考虑其在肠炎向肠癌转化中也发挥重要作用。

以上实验表明，炎症相关miR-146a和癌症相关miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21在UC、CD和CAC中的表达都显著高于正常结肠组织，且在肠炎和肠癌之间也有明显区分，提示miR-146a、miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21可能是参与肠炎向结直肠癌转化的一组miRNAs。

图2　　癌症相关miRNAs在不同组织中的表达水平Fig. 2 Expression levels of cancer associated miRNAs in different tissues

2.2生物信息学分析

2.2.1靶基因合集

利用miRNA靶基因数据库miRWalk 2.0分别对文献中已证明过的miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21的靶基因进行查询，并进行归集汇总，共得到710个靶基因。

2.2.2靶基因集合的功能富集分析

利用DAVID数据库对靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)，结果显示，miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21的靶基因功能分别富集在转录因子调控、RNA代谢过程、细胞表面受体相关信号转导、细胞增殖调控和细胞程序性死亡调控等生物学过程中(P<0.001，图3)。

图3　　差异有统计学意义的生物功能富集得分Fig. 3 Enrichment scores of the biological function processes with statistically significant difference

2.2.3靶基因集合的信号转导通路富集分析

利用DAVID数据库对靶基因进行信号转导通路富集分析(KEGG-analysis，BIOCARTA-analysis)，结果显示，miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21的靶基因富集在结直肠癌相关通路、p53通路、细胞因子和炎症反应通路、MAPK通路及Toll样受体通路中(P<0.001，图4)。

图4　　差异有统计学意义的通路富集得分Fig. 4 Enrichment scores of the pathways with statistically significant difference

3　　讨论

IBD是一种原因未明的结直肠炎性病变，以反复发生的肠道溃疡为特征，患者常表现为腹泻、黏液血便及腹痛。在发病率最高的北美和西欧国家，IBD的发病率为100/10 000～200/ 10 000。我国尚缺乏大规模人群的发病率调查，但最新的一项基于住院患者的研究统计显示，近10年发病人数增加了3倍，说明在我国的发病率呈快速上升趋势。IBD随着病程延长，癌变风险增加。有研究表明，IBD患者与普通人相比患肠癌风险增加了19倍，炎癌转化是IBD患者死亡的主要原因之一，但对于IBD转化为CAC的分子机制目前并不清楚［12］。

本研究选取了结肠组织相关miRNAs、炎症相关miRNAs及原癌miRNAs等3种来源的miRNAs，用RTFQ-PCR方法检测了UC、CD和CAC组织中这些miRNAs的表达情况。结果表明，miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21在这3类组织中较正常肠组织都显著上升，且在结直肠炎和结直肠癌之间也有明显区分，提示其可能是参与结直肠炎向结直肠癌转化的一组miRNAs。miR-27a和miR-29a被报道在结直肠组织中高表达并参与了肠癌的发生、发展，本研究发现这两个miRNAs在IBD中也呈高表达，而经典的原癌基因miR-20a和miR-21在IBD中也显著升高，显示了这些miRNAs在炎症转化为癌症中可发挥动态监测作用，并且可能直接参与IBD转化为CAC的调控。miR-146a是一种在天然免疫中发挥重要作用的miRNA，尤其是参与了巨噬细胞的分化和功能调控［13］。而在对IBD有限的机制研究中，研究者认为，巨噬细胞对IBD的发生、发展起关键作用［14］。与我们的结果结合来看，miR-146a很可能是IBD转化为CAC的重要标志和调控分子。

随着对miRNA研究的深入，机体中miRNA的错综复杂的调控方式也显示出来。miRNA的调控呈现“多对多”的形式，即一种miRNA可以调控多个靶点，而多种miRNA也可能调控一个靶基因［15］。任何生理病理过程都伴随着多种miRNA的变化，意味着对生物学过程的研究不能局限于点和线，而应该着眼于整个动态变化的调控网络。GO功能分析和KEGG通路分析等生物信息学方法的出现［16］，对miRNA相关的基因表达调控网络的研究有很大的帮助，也为机制的实验验证提供了线索，使功能验证不再盲目［17］。本研究对实验挑选出的miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21进行了靶基因功能富集分析和通路富集分析，结果显示，这一组miRNA与癌症相关通路、炎症相关通路、转录因子、细胞因子和细胞因子受体密切相关。该结果提示，筛选的在IBD向CAC转化过程中动态变化的这组miRNA，不仅仅作为检测指标存在，很可能参与了肠组织中炎癌转化的过程。

本研究对IBD组织及CAC组织中miRNA表达的检测和比较将会为炎症转化为癌症提供一种动态监测指标，同时也可为CAC的发生、发展的机制研究提供一条新的思路。

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Investigation of key miRNAs and their target genes in inflammatory bowel diseases and colitis-associated colorectal cancers using miRNA profiling and bioinformatic tools

YIN Yuan1, WANG Cheng2,DAI Xin3, HUANG Zhaohui1
(1. Wuxi Oncology Institute, the Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China; 2. Department of Clinical Laboratory, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China; 3. Cancer Nanomedicine Laboratory, Department of Pharmaceutical Sciences, Mercer University College of Pharmacy, Atlanta 30341, GA, USA)
Correspondence to: HUANG Zhaohui E-mail: hzhwxsy@126.com

Background and purpose: Inflammatory bowel diseases (IBD) are a group of chronic intestinal diseases, including ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD). This study identified differentially expressed miRNAs in UC, CD and colitis-associated colorectal cancers (CAC) to explore their potential as novel molecular biomarkers. Methods: Tissue samples were taken from 13 UC patients, 3 CD patients, 12 CAC patients, and 8 ageand gender-matched healthy controls. The miRNA expressions were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) assay. Known targets of deregulated miRNAs were utilized using miRWalk 2.0 database, and subsequent bioinformatics analysis of these target genes was performed by DAVID software (GO-analysis, KEGG-analysis and BIOCARTA-analysis). Results: The data showed that miR-146a, miR-27a, miR-29a, miR-20a and miR-21 were upregulated in UC, CD and CAC tissues compared with normal control. Moreover, the target genes ofthese miRNAs were enriched in several key signal transduction pathways including cancer-related pathway and immunity-associated pathway. Conclusion: miR-146a, miR-27a, miR-29a, miR-20a and miR-21 may play important roles in the switching from IBD to CAC.

miRNA; Ulcerative colitis; Crohn’s disease; Colitis-associated colorectal cancers; Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction; GO-analysis; KEGG-analysis; BIOCARTA-analysis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.006

R735.3

A

1007-3639(2016)11-0916-06

国家自然科学基金(81301784，81272299，81000867)。

黄朝晖E-mail: hzhwxsy@126.com

（2015-06-11

2016-12-25）