尤萍 方红雁 周诗侗 倪兵



·基础研究·

鼻咽拭子EB病毒DNA检测在鼻咽癌诊断中的价值

尤萍 方红雁＊周诗侗＊倪兵

目的 探讨EB病毒(EBV)-DNA检测方法及其在鼻咽癌(NPC)早期诊断中的价值。方法 应用聚合酶链反应(PCR)荧光定量检测185例疑诊NPC患者鼻咽拭子及外周血EBV-DNA，并进行比较分析。185例疑诊NPC患者最终病理确诊为NPC 141例(NPC组)，其余44例为非NPC组。结果 2组患者鼻咽拭子EB病毒DNA检测的阳性率均较外周血检测的阳性率高，差异有统计学意义；鼻咽拭子EBV-DNA检测在2组间差异有统计学意义(P<0.05)；外周血EBV-DNA检测在2组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 鼻咽拭子EBV-DNA检测较外周血更为敏感，有助于NPC的早期诊断。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：385-387)

Epstein-Barr病毒; DNA; 聚合酶链反应; 鼻咽癌

NPC(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国最常见的恶性肿瘤之一。EB病毒( Epstein-Barr virus, EBV)感染是NPC发生的重要因素[1]，已有文献证实EBV感染与NPC的发病关系密切[2]。然而，目前广泛进行的血液EBV抗体及DNA检测敏感度较低。罗耀凌等[3]报道，NPC患者Ⅰ、Ⅱ期的血EBV-DNA总阳性率仅为20%。因此，部分早期或隐匿性NPC临床诊断往往较为困难。Jebbink等[4]利用核酸分子杂交技术和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)荧光定量技术等检测均表明，不同类型NPC，其组织中都存在EBV基因。为了探索一种敏感度较高的EBV-DNA检测方法，从而指导NPC的早期诊断，本研究对我院疑诊NPC患者分别行病变原发部位的鼻咽拭子及外周血PCR荧光定量检测EBV-DNA，对检测结果回顾比较分析如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年7月～2015年6月我院疑诊NPC(鼻咽部黏膜不光滑或局部隆起或尚未查明原因的颈淋巴结肿大)患者185例，其中男性122例、女性63例；年龄21～74岁，平均50.2岁。病理确诊为NPC(初诊且未接受治疗)的患者为NPC组，共141例，其中TNM分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期26例、Ⅲ47例、Ⅳ期59例，平均年龄为51.0岁；其余44例为非NPC组，平均年龄为47.8岁。

1.2 研究方法 EBV核酸扩增PCR荧光定量检测试剂盒购自广州中山大学达安基因股份有限公司，方法完全按照试剂盒操作过程。实验标准判定也遵循试剂盒判定标准。仪器应用ABI Prism 7500荧光定量PCR仪。分别检测2组病例鼻咽拭子及外周血中的EBV-DNA。结果>1 000拷贝/mL为阳性。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0软件，组间率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

鼻咽拭子EBV-DNA总检出率为80.0%(148/185)；外周血EBV-DNA总检出率为24.3%(45/185)，阳性率差异有统计学意义(χ2=115.0，P<0.01)。2组患者鼻咽拭子及外周血检测EBV-DNA的浓度范围及中位数详见表1。NPC组鼻咽拭子及外周血检测阳性率差异有统计学意义；非NPC组鼻咽拭子及外周血检测阳性率差异有统计学意义；2组鼻咽拭子检测阳性率比较，差异有统计学意义；2组外周血检测阳性率比较，差异无统计学意义(表2)。NPC组早期与中晚期EBV-DNA检测阳性率比较，鼻咽拭子及外周血2种方法比较，差异均有统计学意义;同一方法早期与中晚期比较，差异均无统计学意义(表3)。

表1 EBV-DNA检测的浓度范围及中位数(拷贝/mL)

表2 EBV-DNA检测阳性率[%(n/n)]

表3 NPC组早期与中晚期EBV-DNA检测阳性率比较[%(n/n)]

3 讨论

EBV感染是NPC发生的重要因素。大量研究表明，NPC患者血浆中可检测到EBV-DNA,其复制量随病情加重逐渐升高，且血浆EBV-DNA浓度同NPC转移有关，有远处转移者拷贝数更高[5-7]。PCR荧光定量检测EBV-DNA对NPC的诊断、治疗方案的选择、疗效判定及预后意义重大[8]。然而，临床上我们发现外周血EBV-DNA检出率普遍较低。本研究中，所有疑诊NPC患者EBV-DNA检测，外周血总阳性率为24.3%，而鼻咽拭子的总阳性率为80%，鼻咽拭子的阳性拷贝浓度远高于血液标本，特别是NPC组，外周血阳性率为27.7%，而鼻咽拭子阳性率为95.0%。因此，鼻咽部病变原发部位EBV-DNA检测较外周血更为敏感。

在非NPC组，鼻咽拭子及外周血EBV-DNA阳性率差异同样存在统计学意义。但该组患者数量较少，且未进行严格分类，混杂了淋巴瘤、淋巴结反应性增生及鼻咽炎患者，而EBV感染与咽淋巴环非霍奇金淋巴瘤的发生关系密切[9]，很多淋巴结反应性增生及鼻咽炎患者亦本身存在EBV感染。因此，鼻咽拭子或血EBV-DNA检测阳性同样存在于伴有EBV感染的其他非NPC患者，但本组患者2种方法比较，P<0.05，且EBV复制的拷贝数相对较低。由于本研究为回顾性分析，因获得正常成人的血液及鼻咽拭子EBV-DNA检测结果存在费用及研究对象配合问题，目前缺乏正常成人的阴性对照，为研究中的不足。然而，NPC组与非NPC组鼻咽拭子EBV-DNA检测阳性率比较，差异有统计学意义，而2组外周血EBV-DNA阳性率比较，差异无统计学意义，因此，鼻咽拭子EBV-DNA检测的特异性较外周血高。可见，即便本研究中的非NPC组混杂了同样与EBV感染相关的非霍奇金淋巴瘤等疾病，2组间的差异亦有统计学意义。鼻咽拭子EBV-DNA检测在NPC中的特异性高于其他鼻咽原发性疾病。在NPC组，早期(Ⅰ期+Ⅱ期)或中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)患者鼻咽拭子与外周血2种方法比较，差异均有显著统计学意义，而鼻咽拭子EBV-DNA检测，早期与中晚期比较，差异无统计学意义，提示无论早期还是中晚期鼻咽部EBV-DNA均存在高表达。而外周血EBV-DNA检测，无论NPC组与非NPC组比较，还是早期与中晚期比较，差异无统计学意义，提示外周血EBV-DNA检测特异度极差。因此，鼻咽拭子EBV-DNA检测对NPC的诊断，特别是活检困难的早期或隐匿性NPC的诊断有较好的指导意义。若鼻咽拭子EBV-DNA检测浓度较高，即便无法病理确诊NPC的患者，亦应严密随访鼻咽镜及EBV-DNA浓度的变化以追踪病情进展。

然而，NPC组和非NPC组比较，外周血阳性率差异无统计学意义，且阳性拷贝浓度差异亦不大，而鼻咽拭子阳性率差异有显著统计学意义，且阳性拷贝浓度差异甚大。有研究[10]报道，对于NPC患者，鼻咽上皮细胞的EBV感染是癌变过程中侵袭前的变化，几乎100%的NPC活检组织中存在EBV的基因，且复制的拷贝数目较多。EBV主要分布于鼻咽上皮中，仅少数分布于外周血白细胞。该研究结果亦证实，在NPC或其他EBV感染相关的鼻咽部病变中，病变原发部位的鼻咽拭子EBV-DNA检测均较外周血更敏感，其对鼻咽部病变的诊断有较大的帮助，且鼻咽拭子标本采集方便，也易于临床应用。当然，最终确诊还是依靠病理诊断。

此外，有文献[11]报道，放疗前的NPC患者血浆EBV-DNA浓度上升，治疗后的NPC患者血浆EBV-DNA浓度迅速下降，治疗后再复发者血浆EBV-DNA浓度迅速又回升。龚晓昌等[12]研究表明，并非所有EBV-DNA阳性的NPC患者均被发现复发或转移，但这些患者有近40%将在随后的2～10个月内被诊断为复发或转移。另有其他研究[13]亦认为，NPC患者血浆EBV-DNA水平是反映肿瘤负荷的灵敏指标,可作为疗效评估的参考，其在检测NPC的复发和转移中有重要的意义。我们在临床观察中发现，NPC患者经过放疗后部分患者鼻咽拭子EBV-DNA浓度迅速下降或消失，而少数患者鼻咽拭子EBV-DNA浓度下降并不明显，其是否反映NPC局部控制情况，鼻咽拭子EBV-DNA浓度变化的监测对预后的判断是否具有指导意义，尚需进一步的临床随访观察及总结。

[1] Beier UH, Gurogh T. Implications of galactocerebrosidase and galactosylcerebroside metabolism in cancer cells[J]. Int J Cancer, 2005,115(1):6-10.

[2] Wille CK, Nawandar DM, Panfil AR, et al. Viral genome methylation differentially affects the ability of BZLF1 versus BRLF1 to activate Epstein-Barr virus lytic gene expression and viral replication[J]. J Virol,2013,87(2):935-950.

[3] 罗耀凌,陈浩,彭颂国.联合检测EB病毒不同抗体及EBV-DNA在NPC血清学诊断中的价值[J].中华医学杂志,2013,93(44)：3516-3519.

[4] Jebbink J, Bai X, Rogers BB, et al. Development of real-time PCR assays for the quantitative detection of Epstein-Barr virus and cytomegalovirus, comparison of TaqMan probes, and molecular beacons[J].J Mol Diagn, 2003，5(1):15-20.

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[11] 黄远见,罗志强,贾文辉.NPC患者放化疗前后外周血装EBV-DNA含量变化[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2009,9(6)：353-355.

[12] 龚晓昌，李金高，袁霞，等.血浆EBV DNA水平测定在监测NPC放疗后复发、转移中的临床意义[J].实用癌症杂志，2007, 22(2):150-153.

[13] Silva JM, Garcia JM, Dominguez G, et al. Persistence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients after mastectomy[J]. Ann Surg Oncol，2002，9(1):71-76.

(本文编辑 杨美琴)

Value of Epstein-Barr virus DNA detection in nasopharyngeal swabs for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma

YOUPing,FANGHong-yan＊,ZHOUShi-tong＊,NIBing.

TumorMolecularandCellularBiologyExperimentCenter,theThirdPeople’sHospitalofHonghe,Gejiu661000,China

ZHOU Shi-tong, Email: zst8476@163.com

Objective To explore the detection method of Epstein-Barr virus (EBV)-DNA and its value in the early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC). Methods Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the EBV-DNA both in the nasopharyngeal swab and in the peripheral blood in 185 patients suspected as nasopharyngeal carcinoma, in which 141 cases were pathologically diagnosed as NPC(NPC group) and the other 44 cases as non NPC (non NPC group). Results The objective rate of EBV DNA detected in nasopharyngeal swabs was higher than that in peripheral blood both in NPC group and in non NPC group. However, EBV was highly expressed in nasopharyngeal swabs than in peripheral blood in nasopharyngeal swabs (P<0.05), while the difference of the objective expression of EBV-DNA between the two groups was not significant in peripheral blood (P>0.05). Conclusions It’s more useful for the early diagnosis of NPC to detect EBV in nasopharyngeal swabs than in peripheral blood. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:385-387)

Epstein-Barr virus; DNA; Polymerase chain reaction; Nasopharyngeal carcinoma

云南省红河哈尼族彝族自治州第三人民医院肿瘤分子与细胞生物学实验中心 个旧 661000；＊重庆市人民医院(三院院区)耳鼻咽喉头 颈外科 重庆 400014

周诗侗(Email：zst8476@163.com)

现在重庆市妇幼保健院检验科 重庆 400013

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.06.003

2015-10-26)