没食子酸对肺癌A549细胞的毒性作用及机制研究

2016-12-14郗艳丽白雪松张洋婷马洪波牛凤兰

黑龙江科学 2016年21期

关键词：存活率染色数量

郗艳丽，白雪松，杜鹃，张洋婷，马洪波，牛凤兰

(1.吉林医药学院，吉林吉林 132103； 2.吉林大学，长春 130021)

没食子酸对肺癌A549细胞的毒性作用及机制研究

郗艳丽1，白雪松1，杜鹃1，张洋婷1，马洪波1，牛凤兰2

(1.吉林医药学院，吉林吉林 132103； 2.吉林大学，长春 130021)

没食子酸；肺癌；A549细胞；过氧化氢

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人非小细胞肺癌细胞A549购于中国医学科学院肿瘤细胞库，胎牛血清和RPMI-1640购于Hyclone公司，噻唑蓝(MTT)、没食子酸(GA)、吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB)和DHE染色液购于Sigma公司，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒和BCA检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所，H2O2检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。Tecan infinite M200连续光谱多功能酶标仪购于帝肯公司，Leica DMI 6000B倒置显微镜购于奥林巴斯公司，流式细胞仪购于BD公司。

1.2 MTT法检测各组细胞存活率

A549细胞调节密度至1×105mL-1制成单细胞悬浮液，吸取200μL接种96孔板，待细胞完全贴壁后，移除上清液，加入200 μL预实验筛选出的最佳浓度GA溶液，同时加入SOD溶液或者CAT溶液，设立只加GA溶液及不加药物的空白溶液作为对照组，即将细胞分成空白对照组、GA、GA+SOD组和GA+CAT组。GA组GA终浓度为750 μmol·L-1，GA+SOD组GA终浓度为750μmol·L-1，SOD终浓度为3 000 U·L-1，GA+CAT组GA终浓度为750μmol·L-1，CAT终浓度为200 mg·L-1。24h后在490 nm 波长下检测吸光度(A)值，计算细胞存活率(各组细胞存活率=A样品组/A空白对照组)×100%。

1.3 荧光染色法观察细胞形态

A549细胞以2.5×105mL-1密度接种6孔板，每孔接种2 mL单细胞悬浮液，待细胞贴壁后，吸弃旧培养液，加入用不含血清培养基稀释的药物干预24h，吸弃药物后，加入预冷的PBS洗涤3次，加入AO/EB(AO：0.1 mg·mL-1；EB：10 μL·mL-1)染色液避光孵育5min，吸弃未结合的染色液，用遇冷的PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察细胞并成像，实验重复3次。

1.4 H2O2含量检测

药物处理24h后，吸弃旧培养液，PBS洗涤2次，胰蛋白酶消化，1 000 rpm离心3 min收集细胞，吸弃上清后加入500μL PBS，液氮反复冻融直至细胞破碎，离心后收集上清，按照试剂盒说明书方法检测，测各样品管吸光度值并计算H2O2的含量。

胰蛋白酶消化并收集细胞，吸弃上清后加入浓度为10μg·mL-1的DHE染色液1 mL，37℃避光孵育30min，用无血清培养基洗涤细胞3次，流式细胞仪立即检测。

1.6 结果分析

2 结果

2.1 没食子酸对A549细胞存活率的影响

与对照组比较(100±5)%，GA组和GA-SOD组A549细胞存活率(50.24±9.65)%和(25.10±1.36)%明显降低(P<0.05)，GA-CAT组细胞存活率(78.07±2.59)%虽有降低，但比较差异无统计学意义(P>0.05)；与GA组比较，GA-CAT组A549细胞存活率明显升高(P<0.05)，GA-SOD组A549细胞存活率降低，且比较差异有统计学意义(P<0.05)；与GA-CAT组比较，GA-SOD组A549细胞存活率明显降低，且比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 没食子酸对A549细胞形态学的影响

对照组A549细胞致密，细胞与细胞之间连接紧密，细胞大小基本一致且形态规则；与对照组比较，GA组A549细胞密度降低，数量减少，细胞与细胞之间的间隙增大，许多细胞贴壁不牢，体积变小；GA-CAT组大部分A549细胞形态和大小与对照比较没有明显变化，只有少部分A549细胞呈现了细胞皱缩的形态改变，细胞密度也较对照组密度低；GA-SOD组A549细胞的细胞密度比对照组明显减少，细胞变圆的数量增多。(见图1A)。

对照组A549细胞呈现绿色荧光染色的细胞数量较多，红色荧光染色的细胞数量较少，大部分细胞呈现活细胞状态；GA组A549细胞呈现绿色荧光染色的细胞数量减少，红色荧光染色的细胞数量明显增多；GA-CAT组A549细胞绿色荧光染色的细胞数量较对照组少，但比GA组多，红色荧光染色的细胞数量较对照组多，但较GA组数量少；GA-SOD组A549细胞较对照组、GA组和GA-CAT组红色荧光染色的细胞数量多，且绿色荧光细胞数量少，表明细胞明显呈现晚期凋亡和坏死状态，且发生死亡的细胞占了大多数。(见图1B)。

图1 各组A549细胞形态学Fig.1 Morphology of A549 cells in various groups (A: The morphology of A549 cells observed under microscope; B: The A549 cells stained by AO and EB dyes)

与对照组H2O2含量(29.36±2.70)mmol/g比较，GA作用A549细胞后促进了H2O2含量(75.50±8.88)mmol/g的升高(P<0.05)，GA-CAT组A549细胞H2O2含量(54.84±6.14)mmol/g虽高于对照组，但比较差异无统计学意义(P>0.05)，GA-SOD组A549细胞H2O2含量(102.55±15.10)mmol/g明显高于对照组，且比较差异有统计学意义(P<0.05)；与GA组比较，GA-CAT组A549细胞H2O2含量明显降低，且比较差异有统计学意义(P<0.05)，GA-SOD组A549细胞H2O2含量明显升高，且比较差异有统计学意义(P<0.05)；与GA-CAT组比较，GA-SOD组A549细胞H2O2含量明显升高，且比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

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Toxic effects and mechanisms of gallic acid on lung cancer A549 cells

XI Yan-li1, BAI Xue-song1, DU Juan1, ZHANG Yang-ting1, MA Hong-bo1, NIU Feng-lan2

(1. Jilin Medical University, Jilin 132013, China; 2. Jilin University, Changchun 130021, China)