齐 倩，胡晓琳



·论著·

谷胱甘肽S-转移酶P1基因多态性与支气管肺发育不良的关系研究

齐 倩，胡晓琳

目的 探讨谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)基因多态性与支气管肺发育不良(BPD)的关系。方法 选取2010年3月—2013年12月在武汉市第三医院新生儿科及华中科技大学同济医学院附属同济医院新生儿重症监护室(NICU)住院的患有BPD的早产儿60例为BPD组(其中男38例，女22例)，及同期入住华中科技大学同济医学院附属同济医院NICU无肺部疾病的早产儿99例为对照组(其中男63例，女36例)。釆用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测GSTP1基因多态性。结果 两组GSTP1基因型频率均符合Hardy-Weinbery平衡，具有群体代表性。两组GSTP1基因型频率和等位基因频率间差异均无统计学意义(P>0.05)。两组男性GSTP1基因型频率和等位基因频率间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 GSTP1基因多态性与BPD易感性无关。

谷胱甘肽S-转移酶P1；支气管肺发育不良；多态性，单核苷酸；疾病易感性

齐倩，胡晓琳.谷胱甘肽S-转移酶P1基因多态性与支气管肺发育不良的关系研究[J].中国全科医学，2016，19(34)：4213-4215.[www.chinagp.net]

QI Q,HU X L.Relationship of gene polymorphisms of glutathione S-transferase P1 and bronchopulmonary dysplasia[J].Chinese General Practice，2016，19(34)：4213-4215.

支气管肺发育不良(BPD)常见于早产儿，特别是胎龄小的早产儿。由于其对早产儿的存活率影响较大，目前已成为全球新生儿学研究的热门课题。BPD可由包括遗传易感性、氧中毒、气压伤/容量伤和感染/炎症在内的多种因素诱发，各种因素导致的活性氧水平上升，进而引起细胞氧化损伤是其主要的病理学机制之一，而人体内的抗氧化酶可减少活性氧并调节炎症瀑布，从而为机体提供一定的保护作用[1]。谷胱甘肽转移酶系(GSTs)是一个Ⅱ相反应代谢的超家族酶系，其在肺部抗氧化过程中起重要作用。研究表明，GSTs的单核苷酸多态性(SNP)与其酶的活性密切相关。其中谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)亚群的第5外显子存在SNP位点(A/G)，密码子编码的是缬氨酸(val)或异亮氨酸(ile)，而氨基酸序列的改变影响了酶的活性。研究显示105val形式比105ile形式清除活性氧的效率高，且105ile是多种呼吸道疾病的易患基因[2-4]。鉴于GSTs广泛的抗氧化效应，而GSTP1基因多态性与BPD的相关性在国内还罕见报道，故设计本研究旨在探讨二者间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010年3月—2013年12月在武汉市第三医院新生儿科及华中科技大学同济医学院附属同济医院新生儿重症监护室(NICU)住院的患有BPD的早产儿60例为BPD组，其中男38例，女22例；出生体质量1.10～1.70 kg，平均(1.30±0.22)kg；胎龄28～32周，平均(30.1±1.9)周。纳入标准：(1)均符合BPD诊断标准[1]；(2)出生后持续用氧超过28 d。排除标准：中枢神经系统畸形、膈疝、呼吸系统畸形、严重先天性心脏病(室间隔缺损、房间隔缺损、动脉导管未闭)、染色体异常等致死性先天畸形者。另外选取同期入住华中科技大学同济医学院附属同济医院NICU无肺部疾病的早产儿99例为对照组，其中男63例，女36例；出生体质量1.10～2.00 kg，平均(1.37±0.20)kg；胎龄28～32周，平均(30.5±1.7)周。两组性别(χ2=0.002，P=0.969)、出生体质量(t=2.060，P=0.401)和胎龄(t=1.370，P=0.460)间差异均无统计学意义，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，患儿家属均知情同意并签署同意书。

1.2 方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测GSTP1基因多态性。采集两组患儿静脉血2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用基因组DNA试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司，中国)提取DNA。采用Primer Premier 5.0软件设计引物序列。GSTP1上游引物：5′-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3′，下游引物：5′-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3′，片段长度：433 bp。PCR反应体系20 μl：含10 μl 2×PCR Plus Mix(DBI公司)，1 μl DNA模板，上下游引物各0.5 μl，二次蒸馏水(ddH2O)8 μl。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃再延伸4 min。PCR产物7 μl，加入限制性核酸内切酶Alw26I(Fermentas公司，加拿大)11 μl，磷酸盐缓冲液(PBS)2 μl，总反应体系20 μl。置于37 ℃水浴中消化2 h。消化完毕后取8 μl酶切产物在2%琼脂糖凝胶加样孔内，80 mA电泳30 min，Bio-Rad 凝胶成像系统分析电泳结果。随机取上述PCR产物测序验证PCR-RFLP的准确性和特异性。

2 结果

2.1GSTP1基因PCR-RFLP检测结果 经PCR扩增后得到GSTP1基因PCR产物，经限制性核酸内切酶Alw26I切后，其纯合野生型(AA)的PCR产物被水解为329bp和104bp两个片段；由于A→G变异导致一个新的酶切位点形成，故GSTP1基因纯合变异型(GG)的PCR产物被水解为222bp、107bp和104bp3个片段；而其杂合型(AG)的PCR产物经酶切后则水解为329bp、222bp、107bp、104bp4个片段。由于107bp和104bp不易区分，因此在显色后表现为1个条带(见图1)。

2.2 两组GSTP1基因型频率和等位基因频率比较 两组GSTP1基因型频率均符合Hardy-Weinbery平衡，具有群体代表性。两组GSTP1基因型频率和等位基因频率间差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.3 两组男性GSTP1基因型频率和等位基因频率比较 两组男性GSTP1基因型频率和等位基因频率间差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。

注：1、2、4、5、9为AA基因型，3、6、10为GG基因型，7、8为AG基因型；GSTP1=谷胱甘肽S-转移酶P1

表1 两组GSTP1基因型频率和等位基因频率比较〔n(%)〕

注：GSTP1=谷胱甘肽S-转移酶P1，BPD=支气管肺发育不良

表2 两组男性GSTP1基因型频率和等位基因频率比较〔n(%)〕

3 讨论

BPD的本质是在遗传易感性基础上由各种有害环境因素对不成熟肺造成损伤，以及损伤后的异常修复过程所致[5]。在BPD长达数十年的发病机制研究中，肺氧中毒被确定为重要致病因素之一，由其导致的过量活性氧可氧化蛋白质、脂质或DNA，进而损伤肺部组织细胞并诱导细胞死亡[6]。有报道证实患BPD的早产儿脐血中过氧化物的含量较未患BPD的患儿明显增多[7]；而早产儿缺乏抗氧化能力也是过氧化物造成肺损伤的主要原因之一[8]。

GSTs可催化谷胱甘肽(GSH)的巯基与过氧化物的结合，从而保护DNA及一些蛋白质免受氧化损伤。GSTs主要分为alpha(α)、mu(μ)、pi(π)、theta(θ)和sigma(σ)五类水溶性GSTs，另外还有一类是脂溶性的微粒体同工酶。其中GSTP1在肺脏中含量最高，尤其多分布于肺泡巨噬细胞和肺泡、呼吸性细支气管等肺脏外周部位[9]。GSTP1编码序列中第5外显子内的105位氨基酸残基位于其酶蛋白的疏水性底物结合部点(H-site)，在这一位点上发生氨基酸残基的替换将会改变酶分子的空间构象，进而影响酶与亲电子底物结合的特异性、稳定性及催化活性，并改变蛋白酶的抗氧化能力[10]。所以GSTP1第5外显子基因多态性可能是肺组织抗氧化防御能力个体差异的分子遗传基础之一。在非裔美国人的研究中，发现GSTP1 105ile是BPD的易患基因[11]。试管内的研究证实了105val的解毒效率高于105ile[12]。另有相关研究报道，105ile增加哮喘和特异反应性疾病的易感性[13]。本研究结果显示，两组GSTP1基因型频率和等位基因频率间均无差异，同时考虑到BPD在男性患儿中多见，所以将两组男性GSTP1基因型频率和等位基因频率进一步比较，结果发现两组男性间亦无差异。说明GSTP1基因多态性与BPD易感性无关，分析原因可能为等位基因A在各种族中分布频率不同，基因易患性可能存在种族差异[14]。

BPD的发病原因较为复杂，且有多种病理学改变。单一基因与疾病的相关性鉴定起来非常困难。本课题组将进一步针对肺部氧化-抗氧化机制中的其他抗氧化酶进行多态性研究，并探索多态性位点间的相互作用。目前BPD的预防和治疗效果进入一个平台期，如能识别其“高危基因”，进行有针对的预防和治疗，将使BPD的防治得到突破。

作者贡献：齐倩进行试验设计与实施、撰写论文并对文章负责；胡晓琳进行资料及部分样本的收集。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：崔沙沙)

Relationship of Gene Polymorphisms of Glutathione S-Transferase P1 and Bronchopulmonary Dysplasia

QIQian,HUXiao-lin.

DepartmentofPediatrics,WuhanThirdHospital,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:QIQian,DepartmentofPediatrics,WuhanThirdHospital,Wuhan430060,China;E-mail:125956514@qq.com

Objective To investigate the relationship of gene polymorphisms of glutathione S-transferase P1(GSTP1) and bronchopulmonary dysplasia.Methods 60 hospitalized premature infants with BPD in Neonatology Department in Wuhan Third Hospital,and Neonatal Intensive Care Unit(NICU) of Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology from March 2010 to December 2013 were selected as BPD group(38 boys,22 girls),and 99 hospitalized premature infants without pulmonary disease in NICU of Tongji Hospital,Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology at the same period were enrolled as control group(63 boys,36 girls).The gene polymorphism of GSTP1 was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Results The genotype frequencies of GSTP1,with representativeness of the groups,were consistent with Hardy-Weinbery equilibrium.There was no significant difference in genotype frequency and allele frequency of GSTP1 between the two groups(P>0.05).There was no significant difference in genotype frequency and allele frequency of GSTP1 genotype between males in the two groups(P>0.05).Conclusion The gene polymorphism of GSTP1 is not associated with the susceptibility BPD.

Glutathione S-transferase P1;Bronchopulmonary dysplasia;Polymorphism,single nucleotide;Disease susceptibility

430060湖北省武汉市第三医院儿科(齐倩)；华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科(胡晓琳)

齐倩，430060湖北省武汉市第三医院儿科；

E-mail：125956514@qq.com

R 726.553

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.34.013

2016-07-07；

2016-10-25)