罗 亮，赵炫仲，李昕珊，岳毅刚

（1.桂林医学院 广西 桂林 541000；2.桂林医学院附属医院 广西 桂林 541000）

人参皂苷Rb1注射对兔耳增生性瘢痕中PCNA表达的影响

罗 亮1，赵炫仲2，李昕珊2，岳毅刚2

（1.桂林医学院 广西 桂林 541000；2.桂林医学院附属医院 广西 桂林 541000）

目的：建立兔耳增生性瘢痕模型，通过局部注射人参皂苷Rb1，观察增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA）的表达变化。方法：取8只新西兰白兔，每只兔耳6处创面，建立增生性瘢痕模型，设空白组，地塞米松组，生理盐水组，人参皂苷Rb1组。待伤口上皮化后，局部注射药物，每3d 1次，共三次，空白组不予处理。给药后第1、2、4、8周切除标本行MASSON染色观察瘢痕情况及瘢痕增生高度,免疫组化法检测PCNA表达。结果：注射后4、8周，与生理盐水组比较，地塞米松及人参皂苷Rb1组瘢痕均改善明显，瘢痕增生高度降低（P＜0.05），PCNA表达降低（P＜0.05）。结论：人参皂苷Rb1可有效抑制细胞增殖，改善兔耳增生性瘢痕增生。

增生性瘢痕；人参皂苷Rb1；增殖细胞核抗原；兔耳增生性瘢痕模型；成纤维细胞；瘢痕增生指数

当各种创伤愈合过程中出现成/肌成纤维细胞活性增强并异常增殖，细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）大量合成并沉积且无法吸收，则出现病理性瘢痕，可出现局部症状、影响容貌美观、造成功能障碍。防治策略多为抑制活性细胞增殖、促其凋亡、调节胶原代谢，治疗方法多样[1]然而效果各异，与其发生机制不十分明确有关。近年来，中国传统中药治疗增生性瘢痕研究显示效果良好。本实验以兔耳增生性瘢痕模型[2]为研究对象，局部注射人参皂苷Rb1，观察其治疗效果及细胞增殖情况变化。

1　材料和方法

1.1材料：新西兰白兔，8只，公兔，体重1.9～2.7kg。Rb1由上海源叶生物科技有限公司提供。Masson染色试剂盒购自Solarbio LIFE，SCIENCES. Anti-PCNA antibody购自abcam。兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1建立模型：兔耳腹侧面造圆形创面，每耳6处，直径1cm，间隔1cm，深达软骨。1周后同方法再次原位造创，待其上皮化，模型建立。

1.2.2实验方法：分生理盐水组、Rb1组、地塞米松组及空白组，每组24个样本。空白组不予处理； Rb1组及地塞米松组药物浓度均为1mg/ml，局部注射给药量每次0.3ml，3天1次，共3次。给药后1、2、4、8周随机处死2只兔子，切取样本（含软骨及周边正常皮肤组织0.5cm）。经瘢痕最高处一分为二，置入10%甲醛固定行Masson染色及免疫组化。

1.2.3Masson染色：标本包埋固定切片后行Masson染色（按说明书进行），计算瘢痕增生最高处及周围正常皮肤到软骨的垂直距离比值。

1.2.4PCNA免疫组化：组织切片常规脱蜡、水化，98℃水浴法PH=6.0枸橼酸钠抗原修复20min，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，5%BSA封闭，一抗孵育37℃孵育1h，Polymer Helper室温孵育20min，poly-HRP anti-Rabbit IgG室温孵育30min，DAB显色，镜下确定显色时间，苏木素复染。镜下观察PCNA表达，随机选择3处高倍视野测定细胞阳性率及染色强度，采用H-score法评分，取均值。

1.2.5统计：各组瘢痕增生指数除以空白组增生指数进行数据标准化。软件采用SPSS19.0，计量资料以“x¯±s”表示，采用方差分析，若数据不符合正态性及方差齐性，改用非参数检验。选α=0.05，当P≤0.05，数据有统计学意义。

2　结果

2.1肉眼观察：伤口21d上皮化，局部隆起，呈“山丘样”改变，色红，质硬。给药后随治疗时间延长，瘢痕隆起高度逐步降低，色泽变淡，质地变软，地塞米松及Rb1组较生理盐水及空白组瘢痕改善明显。

2.2Masson染色：早期，表皮增厚，真皮细胞、血管成分增多，胶原纤维排列紊乱，多见胶原结节、“涡旋状结构”，随时间延长，细胞、血管成分逐步减少，胶原纤维呈束状，排列相互平行、较有规律。地塞米松组、Rb1组较盐水组改善明显（见图1）。

图1　第4周Masson染色×200组织结构

2.3瘢痕增生指数：结果见表1，显示第1、2周三组间比较（P＞0.05），第4、8周地塞米松组及Rb1组比较（P＞0.05），但与生理盐水组比较（P＜0.05）。

表1　各组给药后不同时间的瘢痕增生指数比较 (x¯±s n=18）

2.4PCNA表达：PCNA定位于细胞核内，颗粒状，染色强度不一，早期密度高，随治疗时间延长染色强度逐渐降低，表达多聚集于表皮基底部、血管内皮、血管周边、胶原结节周边，此外，散在分布的成纤维细胞亦呈阳性表达，随治疗时间延长，PCNA表达量及染色强度均明显减少（见图2）。

图2　第2周PCNA染色×400组织结构

结果统计情况见图3，分析显示第1、2周三组间PCNA表达（P＞0.05），第4、8周地塞米松组及Rb1组PCNA表达（P＞0.05），但与生理盐水组比较（P＜0.05）。

图3　PCNA表达：#P＜0.05 地色米松组VS生理盐水组；#P＜0.05 Rb1组VS生理盐水组

3　结论

增殖细胞核抗原由Miyachi等[3]于1978年首次发现并命名。仅出现在增殖旺盛的细胞及肿瘤细胞内，是DNA聚合酶的辅助因子。其参与DNA的复制及修复[4]，细胞周期G1晚期开始增加，S期达到高峰，G2、M期明显降低，到G0期最低，其浓度呈周期性波动，与DNA合成变化一致，可用于评价细胞增殖状态，为诊断及预后提供帮助。因此，其可能成为治疗癌症的潜在靶点[5]。

病理性瘢痕[6-7]是创面愈合失控的结果，是各种原因引起的组织病理上表现为活性细胞大量增殖，细胞外基质大量合成并沉积且无法吸收所致。其形成与许多细胞的数量及功能状态有关，其中，成纤维细胞[8-10]是主要的修复细胞，其数量及功能状态是瘢痕形成过程的关键因素。

人参皂苷Rb1研究主要集中于心血管等方面。瘢痕治疗方面已有研究[11-14]显示人参皂甙Rbl可促血管生成、可抑制活性氧物质产生及减少ECM分泌、减少促纤维化相关因子的表达、诱导凋亡产生。本实验结果显示与生理盐水组比较，随给药时间的延长Rb1组及地塞米松组活性细胞及血管成分逐渐减少，PCNA表达的量及强度逐渐减少，改善了瘢痕的增生，可能与药物抑制了成纤维细胞、血管内皮细胞等活性细胞的增殖有关。但亦有研究[15]显示瘢痕增生是由于凋亡太少所致，结果不一致可能因其检测凋亡对象为肌成纤维细胞。在防治策略上，抑制活性细胞增殖和/或调控细胞凋亡均可能成为新的治途径。

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编辑/张惠娟

Effect of Ginsenoside Rb1 on the expression of PCNA in rabbit ear hypertrophic scar

LUO liang1,ZHAO Xuan-zhong2,LI Xin-shan2,YUE Yi-gang2
(1 Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,China; 2.Affilicated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,China)

Objective To observe the effect of ginsenoside Rb1 on hypertrophic scars of rabbit`s ear and test the expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Methods 8 rabbits were chosen randomly and 6 wounds were made in each rabbit ear to establish hypertrophic scars(HS).After the wounds epithelialization,the HS were separated into 4 groups: Blank group,Dexamethasone group,saline group,Ginsenoside Rb1 group. The administration was done once every 3 days for 3 times. On 1st,2nd,4th,8th weeks after the treatment,2 rabbits`s samples were resected randomly to test Masson staining and detect PCNA expression by immunohistochemistry. Results On 4th and 8th weeks after administration,compared with saline group,the scars of dexamethasone and ginsenoside Rb1 group were improved significantly,Scar elevation index reduced (P ＜0.05),the expression of PCNA decreased (P ＜0.05). Conclusion Ginsenoside Rb1 could effectively inhibit cell proliferation and improve scar hyperplasia.

hypertrophic scars;Ginsenoside Rb1;proliferating cell nuclear antigen;scar model of rabbit ear;fibroblast;scar elevation index

R619+.6

A

1008-6455（2016）11-0065-03

桂林市科学技术局科技攻关项目（20140120-1-4）

岳毅刚，男，1959.5，科室主任，教授，瘢痕的病因及治疗；桂林市乐群路20号桂林附属医院整形外科，邮编：541001；E-mail：y.y.g@263.net

2016-07-22

2016-10-25