王 鹏，弓军胜，李晋福，张宝林，郑若楠

（1.山西医科大学第一临床医学院 山西 太原 030001；2.山西医科大学第一医院整形科 山西 太原 030001; 3.上海交通大学医学院附属第九人民医院 上海 200011）

5-Fu作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞后Caspase-3变化的研究

王 鹏1,2，弓军胜2，李晋福1，张宝林2，郑若楠3

（1.山西医科大学第一临床医学院 山西 太原 030001；2.山西医科大学第一医院整形科 山西 太原 030001; 3.上海交通大学医学院附属第九人民医院 上海 200011）

目的：从蛋白层面证明瘢痕疙瘩、正常皮肤成纤维细胞中Caspase-3蛋白表达水平存在差异。通过5-fu(5-氟尿嘧啶)浓度梯度作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后，观察细胞中Caspase-3蛋白的表达，及细胞增殖、迁移和侵袭性变化。方法：临床手术获取瘢痕疙瘩、正常皮肤组织块，培养瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblast KF）及正常皮肤成纤维细胞（normal skin fibroblast NSF），应用免疫组织化学及Western blot检测组织块及细胞中Caspase-3蛋白的表达；将5-fu(5-氟尿嘧啶)浓度梯度作用瘢痕疙瘩成纤维细胞（KF）后，应用Western blot检测Caspase-3蛋白的表达；CCK-8法检测KF细胞增殖情况；Trans-wells小室实验检测KF细胞的体外迁移和侵袭能力。结果：瘢痕疙瘩组织、正常皮肤组织、KF、NSF中均有Caspase-3蛋白的表达；KF中Caspase-3蛋白表达水平明显低于NSF，差异有统计学意义(P＜0.05)，瘢痕疙瘩组织块中Caspase-3蛋白表达水平明显低于正常皮肤组织，差异存在统计学意义（P＜0.05）；5-fu作用KF后，Western blot显示随着5-fu浓度的降低,KF中caspase-3蛋白表达减少,差异存在统计学意义(P＜0.05)。CCK-8结果显示，随着5-fu浓度的降低,对KF增值活性的抑制不断减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)；Trans-well侵袭结果显示侵袭到下室的KF数目随5-fu浓度的不断降低，而增多。结论：Caspase-3在KF中的表达明显低于NS，同时是5-fu诱导KF凋亡的关键因子，5-fu以浓度依赖方式促进Caspase-3活性增高，同时抑制KF增值、侵袭、迁移等肿瘤特性。

瘢痕疙瘩成纤维细胞；正常皮肤成纤维细胞；5-氟脲嘧定子；Caspase-3蛋白；细胞凋亡

瘢痕疙瘩是人类特有的一种真皮的纤维增生性疾病，经常发生在炎症，创伤，烧伤或手术后。虽然它不是致命的，但会严重影响美观，带来瘙痒和疼痛感，这些都会影响到病人的正常生活。瘢痕疙瘩通常被称为良性的真皮肿瘤，因为它超出了原来的伤口的界限，而且不能自发消退，手术切除后复发率大，而且往往会出现加剧的现象。

随着现代科学技术的进步，近年来肿瘤研究进展迅速，不但推动了肿瘤临床诊断和防治水平的提高，并带动了相关学科的发展。研究表明，瘢痕疙瘩在病因、病理机制、临床表现、诊断和治疗等方面均与肿瘤具有类似之处，在一定程度上具有肿瘤的生物学特性，是具有一定肿瘤特性的病变，为此蔡景龙教授首先提出了瘢痕疙瘩发生的肿瘤源性学说[1]，即瘢痕疙瘩与肿瘤具有相似的生物学特点。在瘢痕疙瘩的研究中，部分肿瘤相关因子表达异常，导致瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常，瘢痕疙瘩被认为是皮肤的良性肿瘤，借鉴肿瘤学研究成果开展瘢痕疙瘩的研究日益增多。目前5-氟尿嘧啶（5-Fu）在国内外被广泛用来作为治疗肿瘤的化疗用药，同时5-fu也早已被广泛应用于瘢痕疙瘩的注射治疗，但其在对抗瘢痕疙瘩方面的具体机制还不是很明确。研究表明Caspase家族广泛存在于人体皮肤组织细胞中，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡，而在其中分别扮演启动者和执行者角色的Caspase-8 mRNA和Caspase-3 mRNA显得尤为重要。5-Fu在诱导肝癌细胞凋亡的研究中发现，其能诱导caspase-3、caspase-8的表达增加，从而增加肝癌细胞的凋亡。所以探讨应用5-Fu作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后Caspase-3变化的研究，寻找瘢痕疙瘩形成可能的分子机制以及5-fu治疗瘢痕疙瘩的机制是很有必要的。

1　材料和方法

1.1材料：DMEM培养基、小牛血清蛋白BSA（10g/ L,Gibco公司，美国）；Trans-well小室（聚碳酸脂膜8.0um,Chemicon公司 ，美国），CCK8试剂盒。瘢痕疙瘩标本可以选自我院患者，除外结缔组织、心、肝、肾、肺等疾患，且6个月内未使用类固醇激素类药物、抗肿瘤药物等，未曾接受放疗。术中切取瘢痕疙瘩20例。同时收集其他整形患者的正常皮肤组织20例，入选标准同瘢痕疙瘩。

1.2方法

1.2.1细胞培养：①将切取的得瘢痕疙瘩标本除减去表皮和皮下组织，切成1.0～2.0mm3的组织块，采用组织块培养法进行瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts KF)的原代培养;②切取的正常皮肤组织，应用酶消化法原代培养正常皮肤成纤维细胞( normal skin fibroblasts NSF)。③.中国科学院细胞库购买正常一代皮肤细胞，进行传代培养，以含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的DMEM培养液，与37°C，5%二氧化碳、饱和湿度下培养。

1.2.2免疫组化染色：①瘢痕疙瘩和正常皮肤组织：将标本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，流水冲洗过夜。乙醇梯度脱水后，将标本置于透明二甲苯中浸泡,浸蜡后，进行包埋，切片机切片后用载玻片每个标本捞片4张，将石蜡切片烤干后，脱蜡、水化，用封闭通透液浸润切片后，0.01mol/L柠檬酸钠缓冲溶液（pH 6.0）进行抗原修复暴露抗原决定簇，用山羊血清封闭非特异性蛋白，加Caspase-3一抗（1:500）约50μl，放入湿盒中置于4℃冰箱过夜。2张片加二抗孵育和显色（普通免疫组化），切片复染、脱水、透明、封片后倒置显微镜观察。另外2张片加FITC荧光二抗孵育显色封闭后，荧光显微镜观察。②瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞接种于放置圆形载破片的24孔板，培养24h，PBS冲洗后，多聚甲醛固定，PBS冲洗后，TBS洗涤，PBS冲洗后，用山羊血清封闭非特异性蛋白 ，加Caspase-3一抗（1:500）约50 μl，放入湿盒中置于4℃冰箱过夜。

加二抗孵育和显色 ，切片复染、脱水、透明、封片后倒置显微镜观察。

1.2.3Western印迹检测Caspase-3蛋白表达：取来自不同个体的第三代瘢痕疙瘩成纤维细胞（KF1、KF2）、中科院细胞库第三代正常成纤维细胞（NSF1），非瘢痕疙瘩病人正常第三代皮肤成纤维细胞（NSF2），瘢痕疙瘩组织块，正常皮肤组织块，提取细胞总蛋白。瘢痕疙瘩第三代成纤维细胞，5-fu梯度(0.1mmol/L、0.01mmol/L、0.001mmol/L、0mmol/L)培养2h后，提取细胞总蛋白。BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋 白后电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶TBST溶液封闭过夜后洗膜，分别加入相应的一抗Mouse anti-Caspase-3(1∶500稀释)Mouse anti-GAPDH(1∶5 000稀释)，再分别加入二抗 Rabbit anti-mouse IgGHRP(1∶5 000稀释)，ECL法显色后化学发光成像仪上显影，显影图片扫描后保存图像。

1.2.4CCK-8检测细胞增值率：取对数生长期的瘢痕疙瘩成纤维细胞（细胞密度为1×104/孔），接种于96孔培养板中（100 μl/孔）中。待细胞长成单层后，更换培养液，将不同浓度的5-fu（0.1mmol/L、0.01mmol/L、0.001mmol/L、0mmol/L）加入新的培养液中，然后分别培养2h，再以10μl/孔向各孔中加入CCK-8试剂溶液，继续在细胞培养箱中保温4h，终止培养，震荡摇匀，在全自动定量酶标仪（Bio-Rad）上以450nm波长处测定各孔吸光度，结果以各组6孔吸光度的均值±标准差(x¯±s)表示，吸光度值越高，表示细胞的增殖活性越强。

1.2.5Trans-well侵袭实验，苏木精-伊红(HE)染：采用6孔Trans-well(8.0μm 滤膜微孔)系统。将含0.5%BSA浓度的培养基分为四组，分别加入5-fu(0.001mmol/L，0.01mmol/L，0.1mmol/L，0mmol/L)。用四组配好的培养基调整细胞密度为5×107个／L，分别取1ml细胞悬液加入小室内，下室加入2ml含10%FBS 的培养基，常规培养72h。用棉签擦去小室上面细胞，固定，行HE染色：梯度酒精脱水，苏木精染色约3min，盐酸酒精分化，流水冲洗20min。分化后镜检。伊红染色：0.1%～0.5%伊红染液染色2min，70%乙醇5s。梯度酒精脱水，二甲苯透明2min，倒置显微镜观察。

1.2.6统计学方法：本实验结果均经SPSS 15.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差(x¯±s)表示，采用t检验和方差分析 比组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　实验结果

2.1瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞通过免疫组化实验，Caspase-3蛋白表达情况：可以看到瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中均有Caspase-3蛋白的表达。如图1。

图1　瘢痕疙瘩成纤维细胞、正常皮肤成纤维细胞的Caspase-3免疫组织化学染色照片（400×）

2.2瘢痕疙瘩和正常皮肤组织通过免疫组化实验，Caspase-3蛋白表达情况：可以看到瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤组织中均有Caspase-3蛋白的表达，如图2。

图2　瘢痕疙瘩成纤维细胞、正常皮肤成纤维细胞的Caspase-3免疫组织化学染色照片（100×）

2.3瘢痕疙瘩和正常皮肤组织通过荧光免疫组化实验，Caspase-3蛋白表达情况：可以看到瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤组织中均有Caspase-3蛋白的表达，且瘢痕疙瘩组织中表达量要少于正常皮肤组织。如图3。

图3　通过荧光免疫化学染色显示Caspase-3蛋白表达（100×）

2.4Western blot结果表明：两组正常皮肤成纤维细胞中Caspase-3（32kd）、caspase-3(19kd)蛋白水平均明显高于瘢痕疙瘩成纤维细胞(P＜0.05)，图4。

2.5Western blot结果表明：正常皮肤组织中Caspase-3（32kd），caspase-3(19kd)蛋白水平均明显高于瘢痕疙瘩组织(P＜0.05，图5)。

图4　Caspase-3蛋白在正常成纤维细胞与瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达情况

图5　Caspase-3蛋白在正常成皮肤组织与瘢痕疙瘩组织中的表达情况

2.6Western blot结果表明：5-fu浓度梯度作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞2h后，发现5-fu作用的细胞，Caspase-3蛋白表达较无5-fu作用的细胞表达明显增加，同时通过图可发现随着5-fu浓度的增加，细胞Caspase-3蛋白表达也随之增加，有一定的梯度依赖性。Caspase-3 蛋白的相对分子质量为 32kd , 活化时降解成相对分子质量为 19kd亚单位,检测发现19kd亚单位表达逐渐增高, 说明 caspase-3 被活化 （P＜0.05，图6）

图6　5-fu浓度梯度作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞2h后，Caspase-3蛋白表达，GAPDH是参考蛋白

2.7CCK8实验检测细胞增殖：5-fu浓度梯度作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞2h后，随着5-fu浓度的增高，吸光度明显降低，表示抑制明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05),图7，提示5-fu可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。

图7　5-fu浓度梯度作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞2h后，瘢痕疙瘩成纤维细胞吸光度变化

2.8Trans-well侵袭(图8、9)结果显示随着5-fu浓度降低，侵袭到下室的细胞数目较明显减少(P＜0.05,图8）。说明5-fu有抑制瘢痕疙瘩细胞侵袭的作用。

图8　5-fu浓度梯度作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞72h后，各组的侵袭情况

3　讨论

成纤维细胞异常是瘢痕疙瘩形成的关键，caspase-3与肿瘤的发生发展具有密切的关系，因此瘢痕疙瘩作为肿瘤相关性疾病，其形成和caspase-3的关系也值得深入研究。

Caspase-3是一种半胱天冬酶，其激活后可以抑制Survivin，引起的细胞核变化，在许多细胞凋亡途径的最后一步中起到关键的作用，与细胞凋亡关系密切[2-4]。激活caspase-3细胞会通过旁分泌影响周围caspase-3未激活的细胞。

Caspase-3在肿瘤的治疗中，一直受到广泛的关注，通过各种药物促进caspase-3的表达，促进癌细胞凋亡，治疗癌症取得了令人满意的效果，Parinaz Ahangar等在结直肠癌的研究中发现从鱼油中获取的docosahexaenoic acid（DHA），可以有效激活直肠癌中的Caspase-3蛋白，从而促进直肠癌细胞中caspase-3的表达，癌细胞凋亡明显增加[5]。Yuan-hua Liu等在对肺癌细胞，体外的研究中均发现，金丝桃苷可以通过 Caspase-3 and P53 信号通路，诱导肺癌细胞凋亡同时抑制肺癌细胞的增值，在移植A549 lung cancer进入裸鼠中制作的xenograft tumor model（异种肿瘤移植模型），裸鼠腹腔注射金丝桃苷后，肿瘤体积较为注射前明显缩小，同时血液中肿瘤细胞也同样减少[6]。最近L Flanagan等学者在对结直肠癌的研究中发现了一个有趣的结果，并且发表到了nature系列杂志中，研究发现结直肠癌病人细胞中caspase-3水平越低，以5-fu为基础的化疗方案治疗后，患者disease free survival （无病生存时间）将延长，5-fu可有效激活癌细胞中caspase-3蛋白的表达，从而促进细胞的凋亡，提高患者的生存率，但如果癌细胞caspase-3水平较高，以5-fu为基础的化疗方案效果较差[7]。同时M Oliver MetzigIn等在对结直肠癌的研究中发现，5-FU可以促进caspased蛋白的表达，导致癌细胞的凋亡，但癌细胞对5-fu的抵抗越来越严重，作者将pan-caspase 抑制剂作用于直肠癌细胞后，再用5-fu作用癌细胞，发现无论在体内还是体外实验中均发现取得良好的效果，抵抗明显减少,再一次证明了caspase低表达是有利于5-fu促进细胞凋亡的[8]。本实验通过免疫组织化学证明，caspase-3在瘢痕疙瘩、正常皮肤、瘢痕疙瘩成纤维细胞及正常皮肤成纤维细胞中存在，同时荧光免疫组织化学，发现caspase-3在瘢痕疙瘩中明显低于正常皮肤组织。通过蛋白免疫印迹方法，从蛋白层面证明瘢痕疙瘩成纤维细胞中caspase-3与正常成纤维细胞存在差异，表达水平明显低于正常皮肤成纤维细胞，并且在瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织同样存在这种现象。说明caspase-3的激活，是治疗瘢痕疙瘩重要靶点。

5-氟尿嘧啶是一种嘧啶类抗代谢药，在国际范围内被广泛应用于注射治疗瘢痕疙瘩。Eveline BIJLARD等[9]2015年发表的的系统性回顾中发现有45%～78%的患者在瘢痕疙瘩内注射5-fu后取得了非常好的效果，只有一位病人被证明完全没有效果。目前5-fu注射治疗瘢痕疙瘩的机制，认为5-fu可抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，阻断尿嘧啶脱氧核苷转变成胸腺嘧啶脱氧核苷，从而影响DNA的生物合成。新生血管对抑制细胞增殖药物敏感性高，5-Fu可减少瘢痕疙瘩新生血管内皮细胞增殖[10]。易彤波等[11]在研究中发现论5-fu通过caspase8信号传导通路诱导肝癌细胞凋亡；5-fu诱导caspase8活性升高有浓度与时间依赖性。同时吕军等[12]发现5-fu同样通过caspase3诱导肝癌细胞凋亡，5-fu以时间和浓度的依赖方式促进caspase8的表达，也就是说5-fu可以促进肿瘤细胞的凋亡。本次实验通5-fu梯度作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞后，通过Western blot从蛋白层面证明5-fu同样可以明显提高瘢痕疙瘩成纤维细胞中caspase-3的表达，而且有一定的浓度依赖性，加速瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡，纠正瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡减少异常，最终导致瘢痕疙瘩萎缩，变小。同时本次实验通过CCK8、Transwells等实验证明5-fu同样可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增生，及侵袭等肿瘤特性，并且有一定的浓度依赖性。

综上所述，瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常，而凋亡通路中关键的caspase3在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的低表达可能正是关键原因，5-fu在临床上被广泛应用于瘢痕疙瘩的注射治疗，并且被证明是有效的治疗药物，本次实验从促进瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的角度，解释了5-fu治疗瘢痕疙瘩的机制，同时证明了caspase-3蛋白在瘢痕疙瘩中低表达，导致瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常，为治疗瘢痕疙瘩提供了新思路。

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编辑/张惠娟

The research of changes of the Caspase-3 after 5-FU act on keloid fibroblasts

WANG Peng1,2,GONG Jun-sheng2,LI Jin-fu1,ZHANG Bao-lin2,ZHENG Ruo-nan3
(1.The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University of Shanxi Province,Taiyuan 030001,Shanxi,China; 2.Plastic Surgery,The First Hospital of Shanxi Medical University of Shanxi Province,Taiyuan 030001,Shanxi,China ;3.The Ninth Affiliated Hospital of Medical College, Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200011,China)

Objective To prove the existence of Caspase-3 gene in normal skin fibroblasts and keloid fibroblasts from the protein level. To study the effect of 5-FU(5-fluorouracil) concentration gradient on the expression of Caspase-3 protein and proliferation, migration and invasion of fibroblasts from keliod. Methods ①Immunohistochemistry and Western blot was used to detect caspase-3 protein expression in keloid and normal skin tissue, keloid fibroblast (KF)and normal skin fibroblasts ( NSF) ; ②5-FU (5-fluorouracil) concentration gradient effect of the keloid fibroblasts (KF).Western blot was used to detect the expression of caspase-3 protein expression.CCK-8 test measurement KF cells proliferation. Trans-wells chamber assay KF cells in migration and invasion ability. Results The keloid tissue, normal skin tissue, KF, NSF have the expression of Caspase-3 protein.The expression levels of caspase-3 protein were significant differences between KF and NSF (P＜0.05). The expression levels of Caspase-3 protein were significantly up-regulated after 2 hours of 5-FU act on KF, and the effects were concentration dependent(P ＜ 0.05);CCK-8 results showed that5-fu inhibited proliferative activity of KF, and the effects were concentration dependent(P＜0.05).Trans-wells results that 5-fu inhibited the migration and invasion activity of KF, and the effects were concentration dependen. Conclusion Caspase-3 is involved in the regulation of 5-FU induced KF apoptosis. 5-FU promotes Caspase-3 activity in a concentration dependent manner, and inhibits the tumor characteristics such as KF proliferation, invasion, migration and so on.

normal skin fibroblasts; keloid fibroblast; normal skin tissue; keloid; 5-fluorouracil; Caspase-3; Apoptosis

R619+.6

A

1008-6455（2016）11-0060-05

山西省科技发展计划〈社会发展〉基金（20110313011-7）；山西省卫生与计划生育委员会基金（2014032）；山西医科大学第一医院院基金（YC1415）

张宝林，男，科室主任、教授、主任医师，中华医学会整形分会全国委员、山西省医师协会整形美容协会主委；山西医科大学第一医院整形科，邮编：030001

2016-07-21

2016-10-25