王媛媛，张梦凡，查丽丽，郭 雨

(蚌埠医学院公共课程部，安徽蚌埠 233030)



川牛膝和怀牛膝多糖提取工艺研究

王媛媛，张梦凡，查丽丽，郭 雨

(蚌埠医学院公共课程部，安徽蚌埠 233030)

以苯酚—硫酸法检测多糖含量，采用单因素考察、正交试验探究水煮提取法中料液比、提取时间、提取次数对川牛膝和怀牛膝多糖得率的影响并进行比较。结果表明，川牛膝多糖的最佳提取工艺为料液比1∶13(g/mL)，提取时间2h，提取次数3次；怀牛膝多糖的最佳提取工艺为料液比1∶13(g/mL)，提取时间4h，提取次数3次。两种多糖的最佳提取工艺条件不同，为后期的活性比较及入药选择研究奠定基础，为其工业化生产提供技术支持。

川牛膝；怀牛膝；多糖；提取工艺

川牛膝为苋科植物川牛膝(Cyathulae Radix)的干燥根，味甘、微苦，主要分布于四川、云南、贵州等省份，怀牛膝为苋科植物牛膝(Achyranthis Bidentatae Radix)的干燥根，味苦、酸，主要分布在河北、河南[1]。牛膝多糖是从牛膝中提取分离得到的一类具有较高生物活性的多糖，具有增强免疫、抑制肿瘤转移、升高白细胞和保护肝脏的功能，被广泛应用于免疫调节和肿瘤治疗[2-6]。目前关于两种牛膝药材的鉴别工作模糊，入药选择混乱，两种牛膝多糖的提取工艺及药理活性区别鲜有报道，本研究通过单因素考察和正交试验探究川牛膝、怀牛膝多糖的最佳水煮提取工艺条件，为其工业化生产提供技术支持，同时，明确两种牛膝多糖提取工艺条件的差别，为两者的药理活性及入药选择研究做准备。

1 仪器与实验材料

1.1 仪器

紫外分光光度计(U-3900型，美国日立公司)；电加热器(ZNHW型，上海科升仪器有限公司)；高速离心机(JW-3021H型，安徽嘉文仪器装备有限公司)；旋涡混合器(XW-80A型，海门市其林贝尔有限公司)；移液器(Pipette型，上海盛创有限公司)；分析天平(FA2004型，天津天马衡基仪器有限公司)；中草药粉碎机(HK-02A型，广州市旭朗机械设备有限公司)。

1.2 实验材料

川牛膝饮片(20160101，产地四川，购于安徽亳州)；怀牛膝饮片(20160101，产地河南，购于安徽亳州)；苯酚(AR，20130811，天津市大茂化学试剂厂)；硫酸(AR，XK 13-011-00022，江苏彤晟化学试剂有限公司)；D-无水葡萄糖(AR，20130808，天津市大茂化学试剂厂)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 苯酚—硫酸法测多糖含量的标准曲线

精密吸取0.1g/L的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用去离子水补至2.0mL，依次加入1.0mL 5%苯酚溶液，5.0mL硫酸，用旋涡混合器振荡5min，室温下静置30min，波长为490nm处分别测各样品的吸光度值，以浓度作为横坐标(X)，吸光度值作为纵坐标(Y)绘制葡萄糖含量标准曲线。如图1所示，得到线性回归方程Y=11.114X+0.02814，R=0.9956，在0.00～0.05g/L浓度范围内线性关系良好。

2.2 单因素实验考察多糖提取的最佳条件

2.2.1 最佳料液比

称取10g粉碎后的川牛膝、怀牛膝饮片各5份，料液比(g/mL)分别为：1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16，100℃下加热回流1h进行水煮提取，提取液蒸发浓缩，用去离子水定容到100mL。取200uL进行苯酚-硫酸法显色反应，计算两种多糖得率，如图2所示。结果表明，川牛膝多糖最佳料液比为1∶14，怀牛膝多糖最佳料液比为1∶12。

图2 料液比对多糖得率的影响

2.2.2 最佳提取时间

称取10g粉碎后的川牛膝、怀牛膝饮片各5份，川牛膝料液比(g/mL)1∶14，怀牛膝料液比(g/mL)1∶12在100℃下分别加热回流1h、2h、3h、4h、5h，提取液蒸发浓缩，用去离子水定容到100mL。取200uL进行苯酚-硫酸法显色反应，计算两种多糖得率，如图3所示。结果表明，川牛膝最佳提取时间为2h，怀牛膝最佳提取时间为4h。

图3 提取时间对多糖得率的影响

2.2.3 最佳提取次数

称取10g粉碎后的川牛膝、怀牛膝饮片药材各5份，川牛膝料液比(g/mL)1∶14，100℃下加热回流2h，怀牛膝料液比(g/mL)1∶12，100℃下加热回流4h，分别提取1、2、3、4、5次，合并提取液，蒸发浓缩，用去离子水定容到100mL。取200uL进行苯酚-硫酸法显色反应，计算两种多糖得率，如图4所示。结果表明，川牛膝最佳提取次数2次，怀牛膝最佳提取次数为1次。

图4 提取次数对多糖得率的影响

2.2.4 正交试验考察多糖提取的最佳条件

因素水平设定见表1，设计L9(34)正交实验，称取川牛膝、怀牛膝饮片粉碎后样品10g各九份，以一定的料液比、提取时间及次数，分别在100℃下加热回流，合并提取液，蒸发浓缩，用去离子水定容到100mL。取200uL进行苯酚-硫酸法显色反应，计算两种多糖得率并进行比较，结果如表2、表3所示。

表1 两种多糖提取的因素水平表

表2 两种多糖提取的正交试验结果

表3 两种多糖提取的方差分析表

川牛膝多糖：F0.05(2,2)=19.000，F0.1(2,2)=9.0000

怀牛膝多糖：F0.05(2,4)=6.9443，F0.1(2,4)=18.0000

由表2极差分析结果表明，川牛膝多糖：影响因素C>A>B，即对多糖得率的影响因素中，提取次数>料液比>提取时间，最佳提取条件为A1B2C3，即料液比1∶13，提取时间2h，提取次数为3次；怀牛膝多糖：影响因素C>B>A，即对多糖得率的影响因素中，提取次数>提取时间>料液比，最佳提取条件为A3B2C3，即料液比1∶13，提取时间4h，提取次数为3次，D是空白因素水平，可以在一定程度上反应出实验误差对实验结果的影响。

由表3方差分析结果表明，所选取的各因素中，提取次数为多糖得率的显著性影响因素，这一结果和极差分析结果一致，即提取次数是多糖得率的主要影响因素。

3 讨论

单因素考察结果表明，川牛膝多糖最佳料液比为1∶14，最佳提取时间为2h，最佳提取次数为2次，怀牛膝多糖最佳料液比为1∶12，最佳提取时间为4h，最佳提取次数为1次。根据此考察结果制定正交试验设计的因素水平表。

正交试验设计结果表明，所选取的因素中，提取次数对两种多糖的得率具有显著性影响，川牛膝多糖最佳提取工艺为：料液比1∶13，提取时间2h，提取次数为3次；怀牛膝多糖最佳提取工艺为：料液比1∶13，提取时间4h，提取次数为3次。川牛膝和怀牛膝多糖提取工艺明显不同，揭示在两种多糖的工业生产过程中应注重两种药材的鉴别及提取方法的区别，同时，深入探究两种多糖最佳的提取工艺，提高原药材利用率，可为后期活性评价研究及入药选择工作奠定基础。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版 一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015:38,72.

[2]Feng H B,Du X G,Cao X H,et al.Enhancement of the immune responses to ovalbumin in mice by oral administration of the extract from Radix Cyathulae(RC)[J].Journal of Medicinal Plants Research,2013(19):1272-1279.

[3]Chen C,Wu H,Xu X J,et al.Chain conformation and anti-tumor activity of derivatives of polysaccharide from Rhizoma Panacis Japonici[J].Carbohydrate Polymers: Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides,2014(1):308-316.

[4]Xie F,Sakwiwatkul K,Zhang C R,et al.Atractylodis macrocephalae Koidz. polysaccharides enhance both serum IgG response and gut mucosal immunity[J].Carbohydrate Polymers: Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides,2013(1):68-73.

[5]Liu T,Ye L G,Guan X Q,et al.Immunopontentiating and antitumor activities of a polysaccharide from Pulsatillachinensis (Bunge) Regel[J].International Journal of Biological Macromolecules: Structure,Function and Interactions,2013(3):225-229.

[6]王艳星.牛膝多糖免疫调节作用及其机制的研究[D].温州:温州医科大学,2014

Research on the Extraction Process of Polysaccharides in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radix

WANG Yuan-yuan,ZHANG Meng-fan,ZHA Li-li,GUO Yu

(Department of Public Courses,Bengbu Medical College,Bengbu Anhui 233030,China)

The different factors that affecting the yield of polysaccharides in Cyathulae Radix and Achyranthis Bidentatae Radix by water decocting extraction,including the ratio of solid to liquid,extraction time and extraction times,were detected and compared by the single factor investigation and the orthogonal experiment,while the contents of polysaccharides were detected by phenol-sulfuric acid method. The results showed that the best extraction process of the polysaccharide in Cyathulae Radix was as followes: the ratio of solid-liquid was 1∶13(g/mL),extracted for 2h and repeated for 3times,and the best extraction process of the polysaccharide in Achyranthis Bidentatae Radix was as followed: the ratio of solid-liquid was 1∶13(g/mL),extracted for 4h and repeated for 3times. The optimum conditions of the two kinds of polysaccharides are different,which will lay a foundation for the further studies such as active comparison and selection of medicine of the two polysaccharides,and the results could also provide technical support for industrialize production of the two polysaccharides.

Cyathulae Radix;Achyranthis Bidentatae Radix;polysaccharide;extraction process

2016-08-26

安徽省大学生创新创业训练计划项目“两种牛膝多糖的制备及免疫调节活性比较”(201510367001)；蚌埠医学院自然科学研究项目“两种牛膝药材多糖的制备及抗炎、免疫调节活性比较研究”(BYKY1658)。

王媛媛(1988- )，女，助教，硕士，从事天然产物分析与应用研究。

R917

A

2095-7602(2016)10-0077-05