王 岩(黑龙江省环境应急与事故调查中心 黑龙江 哈尔滨 150040)

低温淀粉菌群筛选及对降解率的影响

王 岩(黑龙江省环境应急与事故调查中心 黑龙江 哈尔滨 150040)

北方大量农业废弃物堆积，通过对农业废弃物筛选，得到淀粉的低温降解单菌。将这些单菌进行混合、复配，得到低温淀粉菌群，使降解率提高12.81％。同时低温淀粉降解菌群可使物料升温，从而进入中温期，带动中温菌株和高温菌株生长、繁殖，产生大量的生物能，进入高温阶段，完成物料的无害化处理。

低温菌株；降解菌；混合发酵剂；淀粉；温度

黑龙江省处于中国最北端，是高寒高纬度地区，同时作为全国的产粮大省，每年有大量的秸秆、畜禽粪便等农业废弃物无法得到及时有效的处置，致使大量秸秆焚烧造成环境严重污染和资源浪费。提高温度是低温发酵技术的关键，快速进入高温期决定整个发酵的周期和无害化进程。

多数淀粉降解菌属于嗜冷菌，嗜冷菌通过自身特殊的生理机制在低温条件下能够降解淀粉并使物料温度迅速升高，从而带动其他有机物降解菌，如纤维素降解菌等中温菌进入中温期。纤维素降解菌的分解作用可以继续提升物料温度，进入高温期完成物料无害化处理。

本试验从实验室中长期保存的土壤、堆肥样品中筛选出不同菌株，根据温度对其的影响，筛选出具有协同作用的低温复合淀粉降解菌剂，用于农业废弃物中淀粉的降解。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试验试剂

乳糖、氯化钾、硝酸钠、氢氧化钠、乙酸钠、羧甲基纤维素钠、硫酸亚铁、苯酚、冰乙酸等分析纯试剂。

牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、微晶纤维素等生物试剂。

乳糖蛋白胨培养基、酪素培养基、羧甲基纤维素培养基、Hutchison液体培养基、酪素培养基等培养基。

1.1.2 试验仪器

YXQ-SG56-480S型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器、SPX-460D-Z型生化培养箱、THZ-56D型气浴恒温振荡器、TGL-34E高速台式离心机、856N型可见分光光度计等仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

样品取自于哈尔滨市信义村的自然堆肥堆，主要成分为牛粪、秸秆等农业废弃物，以及大庆双榆树乡的碱性土壤。

1.2.2 菌株的分离与提纯

取10g样品加入100ml蒸馏水于锥形瓶中，置于120r/min、20℃的摇床中，充分摇动，使菌种完全游离。3d后，按照浓度梯度将菌液进行稀释，并在LB培养基上均匀涂布。菌落生长茂盛后，将单体菌落转接到LB培养基上，反复划线后，得到纯菌落。

1.2.3 低温淀粉降解菌的筛选

将分离、提纯的单菌菌株于15℃条件下，点接在淀粉培养基中培养。菌落生长茂盛后滴加少量碘液，并使碘液均匀布满培养基上。具有分解淀粉能力的菌落周围会出现透明圈，用划线法将其纯化。

1.2.4 低温淀粉降解单菌的混合

将得到的低温淀粉降解单菌进行混合培养，8℃恒温条件下培养5d后观察生长情况。若在两株菌株仍能正常生长则代表此两株菌株间不存在拮抗反应，反之则存在拮抗反应。

1.2.5 低温淀粉降解菌降解率的测定

通过滴定法测定淀粉降解菌的降解率。取菌液10ml，定容至100ml。添加30ml 6mol·L-1的HCl溶液，沸水浴中冷凝回流2h。待冷却后，添加两滴甲基红试剂，再添加10mol·L-1的NaOH溶液，滴加5mol·L-1的HCl溶液使溶液变红，最后添加2.5mol·L-1的NaOH溶液使溶液红色消失，定容至500ml。空白组取100ml蒸馏水，进行相同操作。根据公式计算淀粉含量。

式中：

X—样品中淀粉含量，％；

F—10ml碱性酒石酸铜相当的葡萄糖量，mg；

V—滴定时样品水解液消耗量，ml；

V0—滴定时空白溶液消耗量，ml；

500—样品水解液总体积，ml；

0.9—还原糖换算淀粉的系数。

2 结果与分析

2.1 低温淀粉降解菌株的分离和纯化

低温条件下，降解菌能够保持一定的活性，通过对物料中的淀粉、糖等简单有机物的降解产生生物能并使肥堆升温。选择培养基中透明圈直径D与菌落直径d的比值大小则代表着降解淀粉的能力。

通过表1得知，由样品分离得到的13株单菌中有8株单菌在淀粉培养基中产生透明圈，其中D2和D6的透明圈与菌落直径比值较大，其中D2的D/d为5.86，D6的D/d为5.74。由此可知，D2、D6具有较强的淀粉降解能力。

2.2 低温淀粉降解菌株的混合

表1 菌株的初筛结果

当菌株生长缓慢被其他菌株覆盖时，或是由于相互接触菌株收到抑制无法生长，都说明在菌株间存在拮抗作用。

通过拮抗试验观察，D2与D6单菌菌株混合培养后仍能正常生长，不存在拮抗现象。

2.3 混合低温淀粉降解菌菌群降解率的测定

由于淀粉的结构相对简单，所以分解时容易产生生物热能并提高物料温度。由图1可知，D2和D6两株单菌的淀粉分解能力分别为38.82％和35.48％，明显高于不接菌的对照组，说明这两株菌都具有较强的淀粉降解能力。混合菌株D2+D6的淀粉降解率达到了48.29％，较D2和D6分别提高了9.47％和12.81％。

3 结论

图1 D2、D6及其组合在低温下的淀粉降解率

(1)从普通农业废弃物中筛选出13株单菌，8株具有降解物料中淀粉的功能。其中D2、D6菌株具有较强的降解能力。

(2)混合培养的低温淀粉降解菌的淀粉降解率达到48.29％，相比低温淀粉降解单菌分别提升了9.47％和12.81％。同时提高物料温度，进入中温期，从而带动中温菌株和高温菌株生长、繁殖，产生大量的生物能，进入高温阶段，完成无害化处理。

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Screening of Low Temperature Starch Bacteria and Its Effect on Degradation Rate

WangYan(Environmental Emergency and Accident Investigation Center of HeiLongjiang Province Harbin Hei-Longjiang 150040)

In the north，a lot of agricultural wastes are accumulated.Low temperature degradation monoxenies of starch are obtained by screening the agricultural wastes.The monoxenies are mixed to obtain bacterial flora of low temperature starch，and the degradation rate is increased by 12.81％.Low temperature starch degradation flora can heat material to mesothermal condition and drive the growth and reproduction of mesothermal and mesophilic strains.The process produces a large number of biological energy，enters high temperature stage and completes material harmless treatment.

Low temperature bacteria Degrading bacteria Mixed leavening agent Starch Temperature

X835

A

1674-263X(2016)03-0074-03

2016-09-30

王岩(1989-)男，硕士，助理工程师，从事环境应急管理工作。