罗 群，沈先荣，侯登勇，何 颖，蒋定文，王庆蓉，刘玉明，陈 伟，李珂娴

(海军医学研究所，上海 200433)



船舶舱底油污水生物降解研究

罗 群，沈先荣，侯登勇，何 颖，蒋定文，王庆蓉，刘玉明，陈 伟，李珂娴

(海军医学研究所，上海 200433)

通过驯化富集，从船舶舱底油污水中分离获得了11株油污降解菌，其中菌株J2对舱底油污的降解率最高，在油浓度为1%(φ)，30 ℃，180 rpm振荡培养15 d后，达到了42.66%。将舱底油污与船用柴油按照1:6(φ)混合后，作为降解油相，菌株对混合油的降解率明显高于对舱底油污的降解率，其中9株菌的降解率都高于50%。选取对两种油污降解效果都较好的菌株L7、L8、L10及J2，构建混合菌群，菌群对舱底油污的降解率相对于单菌株提高了30%，达到了73.11%。

舱底水；生物降解；柴油；混合菌群

船舶舱底油污水是水体环境污染的重要来源，舱底油污水主要来自于船舶机舱内冷却系统中海水、淡水的泄漏，燃油、滑油系统中油相的泄漏，蒸汽供热系统中冷凝水的泄漏，各种泵轴密封处的泄漏等[1]，未经处理的舱底油污水的排放会给对生态环境和自然资源造成极大的危害。当前航运业正以飞快的速度发展，船舶石油污染也在不断增加，人类对水体环境的保护也日益重视。为此，国际海事组织(IMO)制定了国际防止船舶造成污染公约MARPOL73/78，其中的附则Ⅰ对船舶油污水的排放作了明确的规定和要求[2]。2004年10月又通过了MARPOL73/78附则Ⅰ修正案，该修正案已于2007年1月正式生效。因此，如何有效地处理船舶舱底油污水对于保护生态环境和自然资源，以及使得舰船能够满足日益严格的环境法规是极其重要的。

目前，大部分船舶上都装有符合要求的油水分离器，但由于油水分离器设备复杂，维护麻烦，而且船舶舱底含油污水中成份极为复杂，所含油种类繁多，并且由于表面活性剂的大量使用，导致其较高的乳化程度，因此要实现船舶舱底油污水的分离并达到国际海事组织规定的排放标准具有很大的难度[3]。生物法是利用微生物的生物化学作用，对废水中石油烃类进行降解，主要是在氧酶的催化作用下，将分子氧结合到基质中，形成含氧中间体，然后再转化为其他无害物质[4]。同传统的或现代的物理、化学修复方法相比，石油污染的微生物修复具有巨大优势：生物修复对人和环境造成的影响最小，它能够使污染物最终分解为二氧化碳和水，而且生物修复过程迅速，费用低[5]。生物处理法作为处理石油污染的一种有效手段，其潜在优势得到广泛认可，具有良好的应用前景[6]。船舶舱底水中存在着可降解石油的微生物，本文利用现代微生物技术，采用驯化富集培养微生物的方法，从舱底水中分离获得对石油污染物具有较好降解效果的石油降解菌，通过对其降解特性的研究，构建高效石油降解菌群，提高舱底水中石油污染物的生物降解效果。

1 实 验

1.1 材料

1.1.1 培养基

基础培养基(LB)：Yeast Extract 5 g，Tryptone 10 g，NaCl 10 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4，121 ℃灭菌20 min。配制固体培养基需另加入20 g琼脂。

无机盐培养基：NaNO30.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，NaH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，CaCl20.02 g/L，FeCl3(痕量)，pH为7.0。

1.1.2 样品及化学试剂

舱底油污水：采集于某船舶舱底。水相：舱底油污水经过油水分离后的水相。油相：舱底油污水经过油水分离后的油相。NH4Cl、K2HPO4、石油醚等试剂均为分析纯，购自上海国药公司。

1.2 方法

1.2.1 石油降解菌的富集

取舱底油污水经过油水分离后的水相100 mL于250 mL锥形瓶中，加入0.5 mL油相(0.5%)、0.14 g氯化铵和0.05 g磷酸氢二钾，在30 ℃，180 rpm的条件下培养7 d，使舱底水中菌体富集；接种1 mL培养液至100 mL经高压灭菌的水相中，加入1 mL油相(1%)、0.28 g氯化铵和0.1 g磷酸氢二钾，在30 ℃，180 rpm的条件下培养7 d；依次将水相中的油浓度提高至1.5%、2%、2.5%，并相应增加氯化铵和磷酸氢二钾的量，在相同条件下培养7 d后，作为富集液，用于石油降解菌的分离。

1.2.2 石油降解菌的分离

将富集液用无菌水依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，10-7、10-8的稀释液。分别吸取0.5 mL不同稀释度的样品滴入LB固体培养基内，涂平板，对应编号，倒置于35 ℃生化培养箱培养1 d。在梯度稀释涂板后长有不同形态大小色泽的单菌落的平板上，挑取具有不同特征的菌落，依次采取平板画线法得到单菌落。挑取单菌落分别接种于LB液体培养基并编号，35 ℃下震荡培养12 h；离心分离得到去除LB液体培养液的菌体，分别接种至50 mL油浓度为2%的灭菌无机盐培养基中，在180 rpm，30 ℃条件下震荡培养10 d后，吸取0.2 mL上述混浊的培养液涂布LB固体平板培养基，倒置于35 ℃生化培养箱培养1 d，观察是否有菌落形成，有菌落形成所对应的单菌落即为石油降解菌。

1.2.3 生物降解实验

将石油降解菌分别接种于LB液体培养基中，35 ℃振荡过夜培养后；将5 mL菌液接种至50 mL水相中，加入0.5 mL 油相，同时加入0.14 g氯化铵和0.05 g磷酸氢二钾，以未接菌和N、P的组别作为空白对照，置于恒温摇床中，在30 ℃，180 rpm条件下振荡培养15 d后。将振荡培养的培养液全部倒入250 mL分液漏斗，用相同体积的石油醚进行萃取三次，合并有机相，在紫外分光光度计225 nm处，以石油醚作参比测定吸光度，根据标准曲线，计算油浓度。油污降解率η按下式计算：

η=(C0-C1)/C0×100%

其中，C0和C1分别为的空白对照组和接菌组的油污浓度。

1.2.4 混合菌群的构建

挑取分离得到降解率较高的石油降解菌L7、L8、L10、J2构建降解菌群。根据表1编号接种对应菌液至装有50 mL水相的锥形瓶中，加入0.5 mL 油相，同时加入0.14 g氯化铵和0.05 g磷酸氢二钾，以未接菌的组别作为空白对照，置于恒温摇床中，在30 ℃，180 rpm条件下振荡培养15 d后，测定油污降解率，测定方法同上所述。

表1 混合菌群的组成

2 结 果

2.1 石油降解菌的分离

从富集液中分离得到11株舱底油污降解菌，分别命名为J1、J2、J3、L1、L3、L5、L7、L8、L10、Z1和Z2，其在固体培养基的生长特征见表2。

表2 各菌株在固体培养基的生长特征

2.2 石油降解菌对油污的降解能力

分离获得的11株降解菌对舱底油污的降解率如图1所示，其中菌株J2的降解率最高，达到了42.66%。将舱底油污与船用柴油按照1:6混合后，作为降解油相，分离获得的11株降解菌对其降解率如图2所示，菌株对混合油的降解率要明显高于舱底油污，其中9株菌的降解率都高于50%，可见菌株对船用柴油具有良好的降解作用。

图1 菌株对舱底油污的降解率

图2 菌株对混合油(舱底油污+柴油)的降解率

2.3 石油降解混合菌群的构建

选取对两种油污降解效果都较好的菌株L7、L8、L10及J2，采用优化组合方法，构建石油降解菌群。不同菌株构建的混合菌群对油相的降解实验结果如图3所示，实验结果表明，并非所有菌群的降解率都高于单菌株，由3株菌组成的混合菌群降解率要高于单株菌和2株菌组成的混合菌群，由L7、L8、L10、J2四种菌构成的菌群对舱底油污的降解率最高，达到了73.11%，混合菌群可显著提高舱底油污的生物降解效果。

图3 混合菌群对舱底油污的降解率

3 讨 论

近年来，随着世界各国环境法规日益复杂和严厉，世界各地对船舶含油污水的排放要求也趋严格，全球关注海洋污染的程度不断加大，改善船舶海洋污染的呼声也越来越高。含油废水是船舶海洋污染的重要来源，一般船舶舱底油污水处理时都是通过各种方法将污水中的油污分离出来，包括物理分离法和化学分离法。我国船舶对含油废水的处理大多采用物理分离法的油水分离装置，主要原理是利用油污与水的密度差对油水混合物进行沉淀后分离。目前船用油水分离器由于存在故障率高、保养繁琐、对乳化液分离效果差等原因，要实现船舶舱底油污水的分离并达到国际海事组织规定的排放标准具有很大难度。

生物处理法在石油污染的环境治理领域已经得到广泛应用，但目前对于船舶舱底油污水的生物处理研究甚少，在船舶舱底油污水中存在着大量的油污降解菌，本文通过富集分离方法，从船舶舱底油污水中分离获得了11株土著油污降解菌，菌株对舱底油污和船用柴油均具有一定的降解能力，为后续采用生物处理法处理舱底油污水提供了宝贵菌种。通过比较菌株对舱底油污和混合油(舱底油污+船用柴油)的降解效果发现，菌株对混合油的降解效果要明显好于舱底油污，这是由于柴油中的组分主要是C11～C22的烃类，更容易被生物降解，而舱底油污中主要是机油、润滑油等长链烃，较难降解。同时，由于石油烃的水溶性差，而水体中的微生物对石油烃的降解需要胞内的各种酶的参与，所以石油烃从油相到胞内的缓慢传质过程是影响石油烃微生物降解的瓶颈，而舱底油污异常粘稠，导致其生物可利用性差，也是影响舱底油污生物降解的一大因素，并且舱底油污覆盖于舱底水表面，阻碍了微生物对氧气的吸收，从而也影响了菌株对舱底油污的降解。

由于不同菌株对不同的油组分降解能力都不尽相同，因此，可以通过利用不同的菌株构建混合菌群，利用菌株间的协同作用，达到提高油污降解率的目的[7]。本文选取对舱底油污和船用柴油降解效果较好的菌株L7、L8、L10及J2，成功构建了高效的石油降解菌群，由四株菌组成的混合菌群对舱底油污的降解率相对于单菌株提高了30%，显示出了良好的舱底油污降解能力，从环境适应的角度考虑，混合菌群对环境的适应性也更强。

[1] Jeong WG，Cho SM.Long-term effect of polycyclic aromatic hydrocarbon on physiological metabolisms of the Pacific oyster,Crassostreagigas[J].Aquaculture，2007，265：343-350.

[2] 许乐平.船舶动力装置技术管理[M].大连：大连海事大学出版社，2006：182-226.

[3] 朱发新,温小飞,卢金树,等.船舶含油污水处理及系统优化研究[J].浙江海洋学院学报:自然科学版，2012,31(5):436-439.

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[5] Venosa AD，Zhu XQ.Biodegradation of crude oil contaminating marine shorelines and freshwater wetlands[J].Spill Sci Technol B，2003,8(2):163-178.

[6] 丁明宇,黄健,李永祺.海洋微生物降解石油的研究[J].环境科学学报，2001，21(1)：84-88.

[7] 谭田丰,邵宗泽.海洋石油烃降解菌群构建及其在降解过程中的动态分析[J].厦门大学学报,2006,45(B05):262-266.

Study on Biodegradation of Ship’s Bilge Water

LUOQun,SHENXian-rong,HOUDeng-yong,HEYing,JIANGDing-wen,WANGQing-rong,LIUYu-ming,CHENWei,LIKe-xian

(The Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433, China)

Eleven bilge oil-degrading strains were isolated from bilge water through enrichment. The strain of J2 had the highest biodegradation ratio of bilge oil that was up to 42.66% after 15 days of incubation at an initial diesel oil concentration of 1%(φ) and an incubation temperature of 30 ℃. The biodegradation ratios of mixed oil (bilge oil : diesel oil=1:6, φ) were higher than that of bilge oil. The biodegradation ratios of nine oil-degrading strains were above 50%. The oil degradation experiments showed that the strain L7, L8, L10, J2 owned relatively high oil-degrading ability, and the bacterial consortiums were formed using these four strains. The bilge oil-degrading ratio of the bacterial consortium was higher than that of single strain, which was up to 73.11%.

bilge water；biodegradation；diesel oil；bacterial consortium

罗群(1986-)，男，助理研究员，主要从事环境污染生物修复研究。

沈先荣(1965-)，男，研究员，主要从事海洋生物研究。

X55

A

1001-9677(2016)021-0096-03