张海超，杨 峰，单莉娅，万慧娟，张 亮，李 丽，司军强，马克涛，李新芝,4

(1. 石河子大学医学院生理学教研室，新疆石河子 832002；2. 华北理工大学附属医院，河北唐山 063000；3. 新疆军区乌鲁木齐第六干休所，新疆乌鲁木齐 830011；4. 石河子大学医学院病理生理学教研室，新疆石河子 832002)



◇基础研究◇

淋巴细胞亚群在不同周龄自发性高血压大鼠和正常大鼠脾脏中的表达差异

张海超1,2，杨 峰3，单莉娅1，万慧娟1，张 亮1，李 丽1，司军强1，马克涛1，李新芝1,4

(1. 石河子大学医学院生理学教研室，新疆石河子 832002；2. 华北理工大学附属医院，河北唐山 063000；3. 新疆军区乌鲁木齐第六干休所，新疆乌鲁木齐 830011；4. 石河子大学医学院病理生理学教研室，新疆石河子 832002)

目的 研究T淋巴细胞亚群在不同周龄的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)和正常Wistar京都(Wistar-Kyoto, WKY)大鼠脾脏中的表达差异。方法 选取16周龄和40周龄雄性SHR和WKY大鼠各8只，监测血压后，通过苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠脾脏病理学变化，应用流式细胞术检测WKY大鼠和SHR脾脏中T淋巴细胞亚群的表达变化。结果 与相同周龄WKY大鼠比较，SHR脾脏中央动脉血管壁增厚，管腔狭窄，且40周龄SHR脾脏病变较16周龄严重； 相同周龄的SHR与WKY大鼠比较，脾脏中CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞比例均无统计学差异(P>0.05)；与16周龄WKY大鼠比较，40周龄WKY大鼠脾脏CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞比例显著降低(P<0.01)，CD3+CD4+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+比值显著升高(P<0.01)；40周龄SHR脾脏CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞以及CD4+/CD8+比值的变化趋势同WKY大鼠相一致。结论 高血压可引起脾脏病理改变，但其对脾脏T淋巴细胞亚群比例可能无显著影响，然而随着周龄的增加，脾脏T淋巴细胞亚群均发生紊乱。

T淋巴细胞亚群；脾脏；自发性高血压大鼠；流式细胞术

原发性高血压是多基因遗传和多种环境因素共同作用下的复杂疾病，近年对其与免疫系统的关系进行了广泛的研究。已证实高血压炎症反应与细胞免疫功能降低密切相关，T淋巴细胞作为重要的免疫细胞，在其中起着重要的调控作用[1]。在免疫应答过程中，T淋巴细胞可发育分化为功能不同的亚群，主要包括CD4+和CD8+亚群。各淋巴细胞亚群之间相互协调，维持机体的正常免疫功能。当淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，机体的免疫功能则会出现紊乱而导致疾病的发生[2]。随着年龄的增长，各淋巴细胞亚群的数量和功能均会发生不同程度的改变。美国病理学家Wolford首次提出老化的免疫学假设，认为免疫系统是调节老化过程的主要调节系统之一，从根本上参与了机体老化过程。

脾脏作为机体最重要的外周淋巴器官，是成熟淋巴细胞的定居部位。脾脏中成熟T淋巴细胞行使着机体“细胞免疫”角色。淋巴细胞参与高血压的发生发展，但是这种改变在不同的器官是否相同尚不明确。因此，本研究通过流式细胞术检测16周龄和40周龄Wistar京都(Wistar-Kyoto, WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)脾脏淋巴细胞亚群，旨在探讨高血压时脾脏内的淋巴细胞亚群变化，并分析随着周龄的增长T淋巴细胞亚群如何改变，为高血压病脾脏免疫功能变化提供理论基础，也为机体免疫老化的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取16周龄和40周龄WKY大鼠和SHR各8只，雄性，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[动物合格证号：SCXK(京)2012-0001]，适应性饲养1周后进入正式实验，动物房室内温度为20～25 ℃，湿度为50%～55%。各组大鼠分笼喂养，给予标准饲料，自由进食水，环境安静。

1.2 主要试剂 FITC标记抗大鼠CD3抗体、APC标记抗大鼠CD4抗体、PE标记抗大鼠CD8a抗体、小鼠源FITC标记IgM，κ同型对照、小鼠源APC标记IgG1，κ同型对照、小鼠源PE标记IgG2a，κ同型对照均购于美国Biolegend公司；10×红细胞裂解液购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 主要仪器 全自动大小鼠无创血压测量仪(四川成都泰盟公司)；流式细胞仪(深圳迈瑞公司)；台式高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；倒置相差显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；血细胞计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物血压的测量 使用全自动大小鼠无创血压测量仪检测WKY大鼠和SHR尾动脉收缩压。测量时先预热，将血压计的充气尾套套在大鼠尾根部，待大鼠安静后，重复测量血压3次，结果取其平均值。

1.4.2 大鼠脾脏病理学的观察 WKY大鼠和SHR称重后给予30 mg/L戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，迅速剖腹取出各自脾脏，置于含预冷磷酸盐缓冲液(PBS)的培养皿中冲洗干净，将脾脏纵切成片状置入甲醛中固定48 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋，冷却后制成厚度为5 μm石蜡组织切片，烘干后进行常规HE染色，光学显微镜下观察脾脏的基本形态和病理学改变。

1.4.3 大鼠脾脏淋巴细胞悬液制备 将WKY大鼠和SHR脾脏置于培养皿中，PBS溶液冲洗干净后放入200目不锈钢滤网上，用眼科剪反复剪碎脾脏，加PBS溶液3 mL使用注射器针芯轻轻进行研磨；取研磨后悬液于1.5 mL离心管中，使用高速离心机1 500 r/min离心10 min，弃上清；加入PBS溶液重悬沉淀，再加入2倍体积红细胞裂解液，充分混匀，室温放置5 min，3 000 r/min 离心10 min，弃上清；经PBS溶液洗涤细胞2次，弃上清；加入PBS溶液重悬制备成脾细胞悬液，在显微镜下用血细胞计数板进行计数并经4 g/L锥虫蓝(台盼蓝)染液染色2～3 min，观察细胞活性>95%；调整细胞悬液终密度为1×107个/mL备用。

1.4.4 脾脏T淋巴细胞亚群的检测 取流式专用染色管，WKY大鼠和SHR按照顺序分别标记为空白、测定管和同型对照管，各管分别加入脾细胞悬液50 μL，测定管中加入CD3-FITC、CD4-APC和CD8-PE小鼠抗大鼠抗体，空白管不加任何抗体，同型对照管加入相同荧光标记的同型抗体，依据抗体说明书调整抗体终浓度。4 ℃避光孵育30 min，随后加入500 μL PBS溶液重悬细胞，经流式细胞仪进行检测。将流式细胞仪调整至最佳工作状态，以FSC/SSC设门并排除死细胞和细胞碎片，根据同型对照调整好实验参数后再进行样本测定，首先设门于CD3+淋巴细胞，然后设门于CD4+和CD8+细胞。所有样本均在2 h内完成对细胞的检测，每管检测20 000个细胞，计算机读出测定值，最后对收集的数据进行分析。

2 结 果

2.1 WKY大鼠和SHR一般资料的比较 在16周龄时，SHR收缩压高于WKY大鼠(P<0.01)；40周龄时，SHR收缩压亦高于WKY大鼠(P<0.01)；但是相同周龄WKY大鼠和SHR之间体质量均无统计学差异(P>0.05，表1)。

表1 两种大鼠一般资料的比较Tab.1 Comparison of the general information of the two groups of rats

2.2 脾脏组织病理学改变 16周龄和40周龄WKY大鼠脾脏中央动脉血管壁均光滑，管壁较薄；16周龄SHR较WKY大鼠脾脏中央动脉血管壁增厚，管腔狭窄(箭头所示)；40周龄SHR脾脏中央动脉血管壁显著增厚，管腔狭窄程度更加严重(箭头所示)(图1)。

图1 WKY大鼠和SHR脾脏组织HE染色Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of the spleen of WKY rats and SHRs (×200)

2.3 相同周龄WKY大鼠和SHR脾脏T淋巴细胞亚群的比较 16周龄时，与WKY大鼠比较，SHR脾脏中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+比值均无统计学差异(P>0.05)。40周龄时，与WKY大鼠比较，SHR脾脏中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+比值亦均无统计学差异(P>0.05，表2)。

表2 WKY大鼠和SHR脾脏T淋巴细胞亚群比值的比较Tab.2 Comparison of the percentage of T lymphocyte subsets in the spleen of WKY rats and SHRs

2.4 不同周龄WKY大鼠脾脏T淋巴细胞亚群的比较 与16周龄相比，40周龄时CD3+T淋巴细胞表达比例显著下降(P<0.05)，CD3+CD4+T淋巴细胞比例显著升高(P<0.01)；40周龄CD3+CD8+T淋巴细胞表达比例显著低于16周龄(P<0.01)，CD4+/CD8+比值显著高于16周龄(P<0.01，图2，表2)。

图2 流式细胞术检测16周龄和40周龄WKY大鼠脾脏T淋巴细胞亚群的表达比例Fig.2 The percentage of T lymphocyte subsets in the spleen of sixteen- and forty-week-old WKY rats detected by flow cytometry

2.5 不同周龄SHR脾脏T淋巴细胞亚群的比较 与16周龄相比，40周龄时CD3+T淋巴细胞表达比例显著下降(P<0.01)，CD3+CD4+T淋巴细胞比例显著升高(P<0.01)，CD3+CD8+T细胞表达比例显著下降(P<0.01)；且40周龄时CD4+/CD8+比值高于16周龄，两者之间差异有统计学意义(P<0.01，图3，表2)。

图3 流式细胞术检测16周龄和40周龄SHR脾脏T淋巴细胞亚群的表达比例Fig.3 The percentage of T lymphocyte subsets in the spleen of sixteen- and forty-week-old SHRs detected by flow cytometry

3 讨 论

原发性高血压严重危害人类健康，可引起全身多个器官的功能损害。近年来研究发现，高血压是一种慢性低级别炎症性疾病。SCHIFFRIN[3]提出T淋巴细胞参与高血压和血管重构的发生发展过程。T淋巴细胞是脾脏中的主要免疫细胞之一。脾脏作为人体最大的外周淋巴器官，是血源性抗原最主要的免疫应答场所，也是淋巴细胞等许多成熟免疫细胞定居的场所[4]。本研究对高血压引起的脾脏病理改变进行检查，发现SHR脾脏中央动脉血管壁增厚，管腔狭窄，且随着周龄增加，病变程度加重。提示高血压可引起脾脏病理损伤。

T淋巴细胞亚群是维持和调节人体正常免疫功能极为重要的细胞，对人体体液免疫和细胞免疫均有重要的调节作用，其中起主要作用的是CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。WALLACE等[5]将妊娠期高血压大鼠的CD4+T细胞移植到正常妊娠期大鼠体内，引起了血压升高。李晖等[6]报道，新疆哈萨克族高血压患者外周血中CD4+T细胞升高，CD8+T细胞降低，CD4+/CD8+异常升高。GUZIK等[7]研究发现在AngⅡ型高血压大鼠主动脉中CD3+CD4+T细胞增多。TIPTON等[8]发现在SHR体内，血压升高会导致肾脏中CD3+、CD4+和CD8+T细胞明显高于WKY大鼠。本研究主要对脾脏中T淋巴细胞亚群在高血压病时的表达变化进行探讨，结果显示，与相同周龄的WKY大鼠比较，SHR脾脏中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+比值均无显著改变。与WEI等[9]采用流式细胞术检测AngⅡ型高血压大鼠的脾脏淋巴细胞变化，得出CD3+细胞浸润增多，但无统计学差异相一致。这提示高血压体内淋巴细胞亚群紊乱，但是脾脏淋巴细胞亚群未发生明显改变，这与淋巴细胞亚群在不同部位表达可能不尽相同有关，但具体原因有待进一步研究。

淋巴细胞各亚群数量的减少和功能的改变是老年人免疫功能衰退的重要因素。有研究报道，老年组外周血CD4+CD45RA+T淋巴细胞的比例较成年组减少，并伴有代偿性的CD4+CD45RO+T淋巴细胞的增多，表明老年人群CD4+T淋巴细胞亚群分布出现异常状态[10]。本研究对16周龄和40周龄大鼠脾脏淋巴细胞亚群的表达变化进行研究，结果显示，与16周龄WKY大鼠和SHR比较，40周龄WKY大鼠和SHR脾脏均出现CD3+T淋巴细胞降低，CD3+CD4+T淋巴细胞升高，CD3+CD8+T淋巴细胞降低，CD4+/CD8+比值增高，均有统计学意义。这可能与周龄增长致使胸腺功能减退，从胸腺迁移到外周的幼稚性T淋巴细胞减少，从而使得大鼠脾脏T淋巴细胞亚群比例改变。赵蕊等[11]研究也显示，老龄糖尿病模型大鼠的脾脏中CD4+T细胞比例增多，且CD4+/CD8+比值明显增高。这表明随着周龄的增长，脾脏免疫功能发生紊乱引起淋巴细胞亚群发生异常改变，从而造成机体免疫衰老。

综上所述，大鼠周龄的增长可造成脾脏淋巴细胞亚群比例紊乱，这很可能是老年机体免疫力下降和容易诱发感染等多种疾病的重要原因。机体免疫老化是一个非常复杂的过程，其具体机制尚需进一步研究。

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(编辑 卓选鹏)

Difference in the expression of lymphocyte subsets in the spleen of spontaneously hypertensive and normotensive rats at different ages

ZHANG Hai-chao1,2, YANG Feng3, SHAN Li-ya1, WAN Hui-juan1,ZHANG Liang1, LI Li1, SI Jun-qiang1, MA Ke-tao1, LI Xin-zhi1,4

(1. Department of Physiology, School of Medicine of Shihezi University, Shihezi 832002;2. North China University of Science and Technology Affiliated Hospital, Tangshan 063000;3. the 6th Residence for Retired Staff of Xinjiang Military Command, Urumqi 830011;4. Department of Pathphysiology, School of Medicine of Shihezi University, Shihezi 832002, China)

Objective To investigate the difference in the expression of T lymphocyte subsets in the spleen of spontaneously hypertensive rats (SHRs) and Wistar-Kyoto (WKY) rats at different weeks of ages. Methods Sixteen-week-old and forty-week-old male SHRs and WKY rats (n=8 respectively) were used in this study. After measurement of blood pressure, the pathological changes in spleen tissue were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. And splenic T lymphocyte subsets of WKY rats and SHRs were detected by flow cytometry. Results Compared with age-matched WKY rats, SHRs showed thickening of central artery vascular walls and luminal stenosis; spleen pathology was more serious in forty-week-old SHRs than in sixteen-week-old SHRs. No significant differences were observed in the percentage of CD3+, CD3+CD4+or CD3+CD8+T lymphocytes in the spleen of age-matched SHRs and WKY rats (P>0.05). Compared with sixteen-week-old WKY rats, forty-week-old WKY rats had a significantly decreased percentage of CD3+and CD3+CD8+T lymphocytes in the spleen (P<0.01), but an increased percentage of CD3+CD4+T lymphocytes and CD4+/CD8+ratio in the spleen (P<0.01). The change tendency for CD3+, CD3+CD4+and CD3+CD8+T lymphocytes and CD4+/CD8+ratio in forty-week-old SHRs was consistent with that in the spleen of WKY rats. Conclusion Hypertension can cause pathological changes of the spleen, but it may not significantly affect splenic T lymphocyte subsets. However, aging may disrupt the homeostasis of T lymphocyte subsets.

T lymphocyte subset; spleen; spontaneously hypertensive rat; flow cytometry

2016-01-08

2016-04-20

国家自然科学基金资助项目(No.31260247, 31460264, 81460098, 81560081)；石河子大学应用基础研究青年项目(No.2015ZRKXYQ-LH13)；石河子大学杰出青年科技人才培育计划项目(No.2012ZRKXJQ01)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31260247, 31460264, 81460098, and 81560081), the Applied Basic Research Youth Project of Shihezi University (No.2015ZRKXYQ-LH13), and Outstanding Science and Technology Youths Training Projects of Shihezi University (No.2012ZRKXJQ01)

李新芝. E-mail: lixinzhi@shzu.edu.cn

R331.3

A

10.7652/jdyxb201606006

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1747.010.html(2016-10-10)