孙 波，宋 琳，罗 肖，孟 凯，闫剑群

(西安交通大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系，陕西西安 710061)



◇基础研究◇

高脂饮食影响雌性大鼠对糖精溶液的喜好并改变多巴胺及阿片相关基因的表达

孙 波，宋 琳，罗 肖，孟 凯，闫剑群

(西安交通大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系，陕西西安 710061)

目的 探讨高脂饮食对雌性大鼠糖精溶液喜好的影响及其可能机制。方法 成年雌性大鼠分成普通饮食组(CHOW组，13.0%热卡来自脂肪)及高脂饮食组(HF组，50.5%热卡来自脂肪)。喂养9周后，称量体质量，检测血浆中的瘦素水平；测量大鼠在双瓶选择实验中对不同浓度糖精溶液的摄入量及喜好率；运用实时定量PCR检测奖赏相关核团及下丘脑中多巴胺及阿片相关基因的表达。结果 与CHOW组相比，HF组有较高的体质量及血浆瘦素水平；HF组对低浓度(0.001 mol/L)糖精溶液的摄入量及喜好率较低，而对高浓度(0.02、0.04 mol/L)糖精溶液的摄入量及喜好率则较高；在奖赏相关核团中，HF组多巴胺再摄取转运体(dopamine reuptake transporter, DAT)的mRNA表达显著增加，多巴胺D1受体、多巴胺D2受体及DARPP-32蛋白的mRNA表达较低，以及μ阿片受体(μ-opioid receptor, MOR)的mRNA表达降低。结论 高脂饮食影响雌性大鼠对糖精溶液的喜好率，该作用可能部分是由奖赏核团中多巴胺及阿片系统的变化导致的“低奖赏”状态引起的。

高脂饮食；糖精溶液喜好率；多巴胺；阿片肽及其受体；奖赏系统

甜味通常被认为是食物富含能量的标志，可以引起机体的愉悦反应并促进摄食。以前的研究表明，机体能量稳态的改变可以影响甜味物质的摄入[1-2]。本课题组之前的研究也显示，营养状态的变化影响雄性大鼠对糖精溶液的摄入，并改变味蕾上甜味受体的表达[3]。但迄今为止，对于营养状态如何影响雌性大鼠对甜味溶液的摄入，仍未见相关报道。

高脂饮食可引起机体肥胖并导致相关代谢综合征。下丘脑对能量平衡的调节起到至关重要的作用[4]。然而，除了能量平衡机制外，食物摄取还涉及到中枢神经系统中与奖赏相关的通路，包括中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)、伏隔核(nucleus accumbens, NAc)、前额皮质(prefrontal cortex, PFC)等[5]。在这些部位中，多巴胺及阿片肽被认为是参与奖赏调节的重要神经活性物质[6-7]。同样，关于高脂饮食如何影响雄性啮齿动物(如小鼠)奖赏系统内的多巴胺及阿片肽表达已有广泛研究[8-9]，但对于雌性动物的研究仍然少见。

本研究以雌性大鼠为实验对象，观察高脂饮食对不同浓度糖精溶液摄入的影响，再进一步探讨该影响的机制，分析是否与奖赏系统内多巴胺及阿片肽的改变有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雌性SD大鼠28只，体质量180～200 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供。动物分笼饲养，动物房温度维持在20～24 ℃，光暗周期为12 h∶12 h，无强烈声光刺激。所有动物适应饲养环境1周，其间自由进食正常大鼠饲料并自由饮用自来水。

随后28只大鼠随机分成2组，即普通饮食组(CHOW组，食物能量为12.5 kJ/g，其中碳水化合物占58.6%，蛋白质占28.4%，脂肪占13.0%；n=14)和高脂饮食组(HF组，食物能量为18.0 kJ/g，其中碳水化合物占28.9%，蛋白质占20.6%，脂肪占50.5%；n=14)。动物自由饮水、摄食，每周称体质量1次，每天记录给食量和余食量。

上述饮食9周后，将动物分成2批进行实验。第1批用于双瓶选择实验(CHOW=8，HF=8)，第2批用于基因表达实验(CHOW=6，HF=6)。

1.2 双瓶选择实验 训练期间，给予第1批大鼠双瓶供水，放置2个刻度饮水瓶(250 mL)于饲养笼前，间隔5 cm，瓶内均为蒸馏水。适应性训练5 d后，进行双瓶选择实验，流程如下：2个饮水瓶(分别为糖精溶液和蒸馏水)；糖精浓度分别为0.001、0.002、0.005、0.010、0.020、0.040 mol/L；实验按糖精溶液的浓度由低到高进行，每一个浓度的糖精溶液的测试时间为48 h。

实验期间，每24 h更换瓶子的位置，以避免大鼠有位置喜好。糖精溶液和水的摄入量通过称量实验前后的瓶子质量计算后获得。糖精溶液喜好率的计算方法为：喜好率=糖精溶液摄入量/(糖精溶液摄入量+水摄入量)×100%。

1.3 取材、体脂含量及血浆瘦素(leptin)水平检测 普通或高脂饮食9周后，将第2批大鼠断头处死(处死前动物禁食4 h)。采血，以3 000 r/min、4 ℃离心15 min，分离血浆，置于―80 ℃保存，用于leptin水平检测(用ELISA试剂盒，武汉华美生物有限公司)；取新鲜脑组织，置于―80 ℃保存，用于基因表达检测；分离皮下脂肪(为肩胛部脂肪及腹股沟脂肪)及腹膜后脂肪，取下后立即用分析天平称重。体脂含量以皮下脂肪或腹膜后脂肪占体质量的百分比表示。

1.4 实时定量PCR检测多巴胺及阿片相关基因表达 根据大鼠脑图谱[10]及相关文献[11]，在上述获取的脑组织上切取VTA、NAc、PFC及下丘脑，并使用Fast 1000试剂盒(先锋生物有限公司)提取总RNA。利用实时定量PCR技术检测以下与多巴胺相关的基因表达：参与合成——酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)；参与再摄取——多巴胺再摄取转运体(dopamine reuptake transporter, DAT)；参与降解——儿茶酚氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT)；参与信号转导——多巴胺D1受体(dopamine receptor D1, drD1)，多巴胺D2受体(dopamine receptor D2, drD2)，以及DARPP-32蛋白(dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein)。按照反转录试剂盒(TaKaRa，日本)的说明，每个样品取500 ng总RNA进行反转录，获得cDNA。实时定量PCR的反应体系为25 μL，其中包含2 μL cDNA、12.5 μL 2×SYBR premix ExTaq(TaKaRa，日本)，正反引物各0.5 μL，dH2O 9.5 μL。引物序列见表1。实时定量PCR的反应条件为：95 ℃持续10 s；95 ℃持续5 s，58～60 ℃持续30 s，40～45个循环(BIO-RAD PCR 热循环仪，iQ5，美国)。将β-actin设为内参基因，利用2-△△Ct法来计算每个目的基因的相对表达。

1.5 统计学处理 各组数据均以均数±标准误表示。用两独立样本均数的t检验对两组数据进行比较，采用SPSS 13.0软件进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used for Real-time PCR

2 结 果

2.1 体质量、摄食量、体脂含量及血浆leptin水平的变化 高脂饮食开始时，两组体质量比较无显著性差异；在喂养第4周后，HF组大鼠体质量增长速度明显高于CHOW组(t=-2.215，P=0.04，图1A)。在整个高脂饮食的9周内，CHOW组及HF组的卡路里摄入量无显著性差异(图1B)。高脂饮食结束时，与CHOW组相比，HF组有较高的皮下脂肪(t=-2.774，P=0.024)及腹膜后脂肪(t=-4.767，P=0.001)含量(图1C)，且有较高的血浆leptin水平(t=-3.467，P=0.008，图1D)。

图1 高脂饮食9周对雌性大鼠体质量(A)、摄食量(B)、体脂含量(C)及血浆leptin水平(D)的影响Fig.1 Effects of 9-week HF diet on body weight gain (A), food intake (B), adipose depots (C) and plasma leptin level (D) in female rats

2.2 双瓶选择实验结果 与CHOW组相比，HF组对0.001 mol/L糖精溶液的摄入量(t=2.463，P=0.043)及喜好率(t=2.455，P=0.044)均较低；而HF组对0.02 mol/L及0.04 mol/L糖精溶液的摄入量(0.02 mol/L：t=-3.214，P=0.012；0.04 mol/L：t=-3.205，P=0.013)及喜好率(0.02 mol/L：t=-2.520，P=0.036；0.04 mol/L：t=-2.397，P=0.043)则高于CHOW组(图2)。

图2 双瓶选择实验中糖精溶液的摄入量(A)及喜好率(B)Fig.2 Saccharin intake (A) and preference ratio (B) in two-bottle preference test

2.3 多巴胺相关基因的表达变化 在VTA、NAc及PFC中，HF组均有显著增加的DAT mRNA表达(VTA：t=-3.664，P=0.004；NAc：t=-3.252，P=0.009；PFC：t=-3.017，P=0.013，图3)。与CHOW组相比，HF组在VTA中有较低的TH mRNA表达(t=2.344，P=0.041，图3A)，并且在NAc中有较低的D1受体(t=2.600，P=0.026)、D2受体(t=2.924，P=0.015)及DARPP-32蛋白(t=2.685，P=0.023)的mRNA表达(图3B)。对于下丘脑中的各个基因的mRNA表达，两组间未发现显著性差异(图3D)。

图3 多巴胺相关基因在中脑腹侧被盖区(A)、伏隔核(B)、前额皮质(C)及下丘脑(D)内的mRNA表达Fig.3 mRNA expression of dopamine-related gene in VTA (A), NAc (B), PFC (C) and HYP (D)

2.4 阿片肽及其受体相关基因表达 在NAc及PFC中，HF组均有较低的μ阿片受体(μ-opioid receptor, MOR)的mRNA表达(NAc：t=3.553，P=0.005；PFC：t=2.467，P=0.033，图4A和4B)。与CHOW组相比，HF组在NAc中有较高的脑啡肽原(preproenkephalin, PENK)的mRNA表达(t=-4.040，P=0.002，图4A)。对于下丘脑中的各个基因的mRNA表达，两组间未发现显著性差异(图4C)。

图4 阿片肽及其受体相关基因在伏隔核(A)、前额皮质(B)及下丘脑(C)内的mRNA表达Fig.4 mRNAexpressionofopioid-relatedgeneinNAc(A),PFC(B)andHYP(C)

3 讨 论

双瓶选择实验被广泛应用于检测啮齿类动物对味觉溶液的喜好[12-13]，但部分研究者认为，行为学的检测结果很大程度上受摄食后效应的影响[14-15]。虽然糖精可以与肠道上的受体结合并引起相关的生理反应，但作为一个不含热量的甜味剂，摄食后效应要远远小于其他含有热量的甜味剂[16-17]。因此，在本实验选择糖精溶液作为甜味觉溶液。

本研究结果显示，9周的高脂饮食使雌性大鼠对低浓度(0.001 mol/L)糖精溶液的喜好降低，而对高浓度(0.020、0.040 mol/L)糖精溶液的喜好增加。而本课题组之前的研究显示，6周的高脂饮食使雄性大鼠对0.010、0.020、0.040 mol/L糖精溶液的喜好均降低[3]。分析可能是以下因素导致实验结果的不同：首先，动物性别不同，雌性激素可能影响甜味觉喜好；其次，雄性大鼠从断乳后开始，进行6周的高脂喂养，而本实验中，雌性大鼠则是从成年开始，进行9周的高脂喂养；再次，雄性大鼠进行双瓶选择实验时间为2 h，而本实验中雌性大鼠进行48 h。

本课题有一个令人感兴趣的研究结果——与CHOW组相比，HF组的能量摄入并没有增加，但是HF组却有增加的体质量及体脂含量。一个可能的解释是，虽然摄入量相同，但HF组大鼠有较低的能量消耗，比如运动量减少，但这些推测都有待进一步证实。此外，这个结果也说明，增加的体质量是由高脂饮食本身引起的，而不是由过多的能量摄入引起的。

基于HF组大鼠对糖精溶液的喜好率有变化，我们推测9周的高脂饮食可能改变奖赏系统中多巴胺及阿片相关基因的表达。结果发现，VTA、NAc及PFC中的DAT mRNA表达均升高，并且NAc中的D1受体、D2受体及DARPP-32蛋白的mRNA表达降低。这些变化可以导致一个“低多巴胺能”的状态——多巴胺再摄取增加(DAT增加)[18]以及多巴胺信号转导降低(D1受体、D2受体及DARPP-32蛋白降低)。研究显示，“低多巴胺能”的状态可能会导致机体对可口物质的摄入增加，以此来恢复奖赏系统的稳态[19]。此外，本研究发现，下丘脑内的多巴胺相关基因并没有显著变化，说明高脂饮食主要改变奖赏核团中的多巴胺系统。

与之前的研究[9]一致，我们发现HF组在NAc中有升高的PENK mRNA表达。PENK升高可能会加快肥胖发生的进程，已有研究发现，注射脑啡肽可使机体对高脂食物的摄入增加[20]。NAc及PFC中的MOR降低也会导致机体处于一个“低奖赏”的状态，通过增加对可口食物的摄入，从而缓和这种状态[21]。与多巴胺相关基因的表达相似，下丘脑内的阿片肽及其受体相关基因表达也没有显著变化，说明高脂饮食主要改变奖赏核团中的阿片系统。

综上所述，本实验结果表明，9周的高脂饮食使雌性大鼠对低浓度的糖精溶液喜好降低，但对高浓度的糖精溶液喜好增加；可能由于高脂饮食使机体处于一个“低奖赏”的状态[22-23]，通过增加对可口食物的摄入，从而恢复奖赏系统的稳态。对于其他的可能机制，如味蕾上甜味觉受体的变化，及中枢内甜味觉相关神经元的电活动变化，仍有待进一步研究。

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(编辑 国 荣)

High-fat diet alters saccharin preference and dopamine and opioid related gene expression in female rats

SUN Bo, SONG Lin, LUO Xiao, MENG Kai, YAN Jian-qun

(Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences,Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

Objective To determine whether high-fat (HF) diet affects preference for saccharin solutions in female rats and the possible underlying mechanisms. Methods Adult female Sprague-Dawley rats were divided into 2 groups: CHOW group was fed with a normal chow diet (13.0% calories from fat) and HF group with an HF diet (50.5% calories from fat). At the end of the 9th week, we measured body weight gain and plasma leptin levels, saccharin intake and preference using a two-bottle preference test, and dopamine and opioid related gene expression in reward-related nuclei and hypothalamus using real-time PCR. Results Compared with CHOW group, HF group had greater body weight gain and higher plasma leptin levels. The consumption and preference ratio for 0.001 mol/L saccharin were lower in the HF rats, while the consumption and preference ratios for 0.02 and 0.04 mol/L saccharin were higher in these rats. HF group had higher dopamine reuptake transporter (DAT) mRNA expression, lower dopamine receptor D1, dopamine receptor D2 and DARPP-32 dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein mRNA expression, and lower μ-opioid receptor (MOR) mRNA expression in reward-related nuclei. Conclusion HF diet affects preference for saccharin solution in female rats, and it may be partially due to the state of reward hypofunction induced by alterations of dopamine and opioid system in reward-related nuclei.

high-fat diet; saccharin preference ratio; dopamine; opioid ligands and receptors; reward system

2016-03-21

2016-05-10

国家自然科学基金资助项目(No.31300966)；陕西省自然科学基础研究计划项目(No.2014JQ4124)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31300966) and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2014JQ4124)

闫剑群. E-mail: jqyan810@163.com

R338

A

10.7652/jdyxb201606003

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161013.0952.012.html(2016-10-13)