逯南南，李汝，宋武昌，孙韶华，贾瑞宝,*

1.山东省城市供排水水质监测中心，济南250021

2.山东建筑大学，济南250101

马拉硫磷和百菌清胁迫下斑马鱼行为变化的研究

逯南南1，李汝2，宋武昌1，孙韶华1，贾瑞宝1,*

1.山东省城市供排水水质监测中心，济南250021

2.山东建筑大学，济南250101

以马拉硫磷和百菌清为胁迫因子,本文研究了2种污染物暴露下斑马鱼行为强度的变化。首先通过急性毒性试验确定了2种农药对斑马鱼24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度(LC50),其次以LC50-48h为1个染毒单位(TU),在0.01 TU、0.1 TU、0.5 TU、1 TU、2 TU 5个条件下,本文开展了斑马鱼行为学研究。结果显示,48 h马拉硫磷暴露斑马鱼的LC50为5mg·L-1,百菌清暴露斑马鱼的LC50为0.01mg·L-1。随着污染物浓度增大,综合行为强度变化幅度增大。在设置的暴露浓度下,斑马鱼的行为强度在急剧增大或减小后都出现了明显的调节适应过程,基本符合环境压力模型。通过比较在不同频率下的影响强度,马拉硫磷和百菌清暴露斑马鱼摆鳍所受影响最大。本研究提示,水质监测中可增加斑马鱼摆鳍观察指标。

马拉硫磷；百菌清；斑马鱼；行为变化

近年来水体污染日益严重,水污染事件频发。经调查,农业生产过程中使用的肥料和农药等,是造成水域面源污染的重要因素[1-2]。马拉硫磷和百菌清是农业生产中常见的两种农药,其中马拉硫磷为一种高选择毒性的有机磷农药,在世界范围内应用广泛,水体中的检出率较高[3]。百菌清是一种非内吸性广谱杀菌剂,广泛用于蔬菜、果树、豆类、水稻、小麦等多种作物病害的防治。由于其普遍性、高生物毒性和难降解性,水体中马拉硫磷和百菌清的监测及其对生物体的毒性研究越来越受到重视。

鱼类在水环境中的行为特征可以反映水体健康状况,当水环境发生变化时,鱼类对环境的适应性最先表现为行为改变[4],行为变化已作为描述污染物胁迫的一项重要综合生物指标用于水质监测[5]。基于鱼的呼吸行为和运动行为监测的水质预警技术在国内外已有大量研究[6,7],广泛应用于水源地、河流、污水处理厂等水质的监测。本研究以马拉硫磷和百菌清为胁迫因子,研究农药类污染物胁迫下斑马鱼的行为响应机制,为农药类突发污染的在线监测提供技术支撑。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 供试生物

斑马鱼,购于济南某花鸟鱼虫市场,经实验室驯养2周后用于试验,体长3～4 cm,体重(0.3±0.1)g。驯养条件:置于水温为(25±2)℃,连续曝气的自来水中,光照:黑暗=12 h:12 h,每天并喂食1次,以5 min内鱼食吃完为宜,试验前24 h及试验过程中不喂食。整个驯养期间死亡率＜10%,方可用于试验。

1.1.2 试验仪器

水质安全在线生物预警系统BEWs-03(中国科学院生态环境研究中心)。

1.1.3 试剂

84%马拉硫磷EC乳油、75%百菌清可湿性粉剂。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性试验

参照《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》(GB/T13267-91)要求操作[8]。

1.2.2 行为学监测

以急性毒性试验结果为依据,48 h半致死率(LC50-48h)设定为1个染毒单位(1 TU),每种农药设定0.01 TU、0.1 TU、0.5 TU、1 TU、2 TU 5个浓度进行试验。试验采用流水式试验,流速2 L·h-1,每个通道放置2条斑马鱼,生物综合行为强度[9]为判定指标,研究不同污染物浓度下斑马鱼的行为变化。

1.2.3 数据分析

首先对不同频率下斑马鱼行为变化研究中对试验测定数据做如下修正:

其中0.5 hz、1.0 hz、1.5 hz、5.0 hz 4个频率i的取值分别为1、2、3、4；Ii表示不同频率下斑马鱼行为强度值的修正值；I0i表示不同频率下斑马鱼行为强度测定值。数据分析利用SPSS20软件完成,使用修正后的数值进行多重比较(Duncan法)。

2 结果(Results)

2.1 急性毒性试验

在试验中观察到随着马拉硫磷浓度增大,鱼鳃、腹部出现红色出血症状,鱼体出现侧游、漩游、翻滚、仰翻、沉底失去平衡等中毒症状,伴随作用时间延长运动能力下降,躺卧死亡。而在百菌清暴露下鱼体活跃度很高,四处乱窜,鱼体仰翻,鳃丝发红,身体弯曲,漂浮水面死亡。该现象与吴声敢、赵于丁等[10-12]学者的研究结果相似。

利用统计软件SPSS20进行Probit模型线性回归,计算得出各个作用时间下污染物对斑马鱼的半致死率LC50如表1所示,马拉硫磷和百菌清暴露下斑马鱼 LC50-48h分别为4.867mg·L-1和0.009mg·L-1,定义5mg·L-1和0.01mg·L-1为2种农药的1个染毒单位。根据现行的《化学农药环境安全评价试验准则》中提出农药类物质对鱼类毒性的分级标准(LC50-48h)[13-14],马拉硫磷和百菌清对斑马鱼属于中毒和剧毒物质；而根据国家环保部发布的《新化学物质危害评估导则》对鱼类急性毒性的分级标准(LC50-96h)[15],马拉硫磷和百菌清对斑马鱼属于高毒和剧毒物质。按照常规的计算方法安全浓度(SC=0.1×LC50-96h)2种物质对斑马鱼的SC分别为0.432mg·L-1和0.0006mg·L-1,均低于地表水环境质量标准限值。

表1 马拉硫磷和百菌清对斑马鱼的急性毒性试验结果Table 1 Acute toxicities of malathion and chlorothalonil to zebrafish

2.2 行为强度变化研究

马拉硫磷和百菌清2种农药暴露下斑马鱼的行为强度变化如图1所示,可以看出对照组(即污染物浓度为0)鱼的行为强度在0.6左右上下浮动,基本保持稳定,可以用于污染物的暴露试验。两种污染物暴露下,随着污染物浓度的增大和暴露时间的延长,斑马鱼的行为强度呈现下降的趋势。2种农药0.01 TU浓度暴露斑马鱼的行为强度与对照组相比没有明显的变化,0.1 TU、0.5 TU、1 TU的暴露浓度下,斑马鱼的行为经历了刺激、调整、适应再降低过程,符合刘勇等[16]建立的污染物胁迫下的日本青鳉逐级行为模型；而在高浓度(2 TU)暴露中,斑马鱼的行为强度在经历一个逐渐降低过程以后,逐渐趋于0。在此过程中也存在明显的行为调节,其中马拉硫磷试验组出现在暴露6 h以后,百菌清组则是出现在暴露10 h以后。

图1 马拉硫磷和百菌清对斑马鱼行为强度的影响(A:马拉硫磷，B:百菌清)Fig.1 Effects of malathion and chlorothalonil on the behavior strength of zebrafish(A:malathion,B:chlorothalonil)

2.3 不同频率下行为强度的研究

据水质安全在线生物预警系统(BEWs)配套资料可知,该系统能够监测0.5 hz、1.0 hz、1.5 hz、5.0 hz 4个频率下的斑马鱼行为强度变化,分别表示斑马鱼的游动、摆动、摄食、摆鳍4种运动行为。我们以1 TU浓度暴露试验为例分析了2种农药对斑马鱼不同行为指标的影响。斑马鱼不同频率下相对行为强度变化多重比较结果表明,马拉硫磷暴露对斑马鱼行为影响程度大小排序为摆鳍＞摄食＞游动＞摆动,而百菌清暴露下为摆鳍＞摄食＞摆动＞游动,摆鳍与游动、摆动、摄食三者之间均有显著性差异,而游动、摆动、摄食之间无显著性差异。2种污染物暴露均对鱼体摆鳍行为影响最大,可能因为同为农药类污染物,对斑马鱼毒性作用机制相似。

图2 不同行为指标多重比较结果注:a、b为两个不同的区间,影响程度a＞b,不同区间内的项目差异显著,同一区间内的项目无显著性差异。Fig.2 The results of multiple comparison with behavioral indicatorsNote:“a”and“b”for two different interval,order of influence:a＞b, significant difference was found between different interval and no significant difference was found in the same interval.

3 讨论(Discussion)

Gerhardt等[17]研究证明在一定的水体环境下,利用不同频率信号记录的生物的游动、爬行、行走和呼吸等运动行为参数都在一个稳定范围内变化。本研究中对照试验组斑马鱼的综合行为强度保持基本稳定,为后续的污染物暴露提供了可靠的参照。鱼体对化学刺激品有敏锐的感受器官,它不仅能感觉到环境的改变,还能对这些变化做出回避、咳嗽等多种行为回应[18]。根据环境压力模型,生物体受到外界刺激时,其行为强度主要经历刺激、适应、调整、甚至再调整,直至产生明显行为毒性效应的过程[19]。赵晓燕等[20]研究了抗生素和有机磷农药暴露下斑马鱼行为强度的变化,发现随着药物浓度的增加,斑马鱼行为变化的强度增大,响应时间缩短,且行为强度的变化符合环境压力模型；刘勇等[16]研究了有机磷农药暴露下日本青鳉鱼的行为响应,构建了污染物联合胁迫下的逐级行为模型。本研究发现2种农药暴露下,污染物浓度越大,综合性为强度的变化幅度越大,表明污染物的毒性在增加。在设置的暴露浓度下,斑马鱼的行为强度在急剧增大或减小后都出现了明显的调节适应过程,“适应期”内鱼体通过对自身行为和生理机能的调节,逐步适应了外界环境的压力,整个暴露期内鱼体行为强度的变化基本符合环境压力模型,与前人的研究结果一致。

大量的研究表明农药类污染物对水生生物存在毒性效应[21-23],可通过呼吸、食物链和体表3个途径进入生物体内,对水生生物的糖类、蛋白质、脂质等3大类的代谢产生影响,影响鱼类行为和生理效应[22]。马拉硫磷作为一种有机磷杀虫剂,是乙酰胆碱酯酶的神经毒剂,主要通过马拉硫磷活化代谢产物来实现对胆碱酯酶的抑制[24],导致乙酰胆碱过量蓄积,造成体表分泌黏液,肝脏颜色变淡,颅腔充血以及行为学的改变。百菌清对斑马鱼的毒性机制可能为影响鱼脑中酪氨酸转氨酶(TAT)的表达调控,进而影响机体糖代谢水平,造成体内ATP水平降低,鱼体活性减弱[25]。

由于鱼体的行为变化要提前于生理损伤或死亡,能够在第一时间实现在水体中污染物的监测预警,对2种农药暴露下斑马鱼不同频率的行为强度研究发现,2种农药均对斑马鱼的摆鳍行为影响最为显著,建议在进行综合行为强度监测的基础上增加鱼体摆鳍行为的监测,进一步提高生物监测的准确性和可靠性。在后续的研究中,应将污染物的行为影响和毒性机理研究相结合,更好的服务于水质监测。

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Study on Behavioral Change of Zebrafish Exposed to Malathion and Chlorothalonil

Lu Nannan1,Li Ru2,Song Wuchang1,Sun Shaohua1,Jia Ruibao1,*
1.Shandong Province City Water and Drainage Water Quality Monitoring Center,Jinan 250021,China
2.Shandong Jianzhu University,Jinan 250101,China

28 May 2015 accepted 20 July 2015

Behavioral changes of zebrafish exposed to malathion and chlorothalonil were studied in this paper.After treatment for 24 h,48 h,72 h and 96 h,median lethal concentration was determined by acute toxicity test.Employed LC50-48has a toxic unit(TU,toxicity unit),behavioral test of zebrafish exposed to 0.01 TU,0.1 TU,0.5 TU, 1 TU and 2 TU were also implemented.Result from this study demonstrated that LC50values of the adult zebrafish exposed to malathion and chlorothalonil for 48 h were 5mg·L-1and 0.01mg·L-1respectively.Associated with upregulation of pollutant concentrations,zebrafish behavior strength changes appeared an increasing trend.And there was a regulation and adaptation process after dramatically increasing or decreasing of its behavior strength,which was accorded with environmental stress model.According to multiple comparisons of behavioral indicators at dif-ferent frequencies,zebrafish fins swing was observed to be the most significantly influenced by malathion and chlorothalonil.This study suggests that the monitoring of zebrafish fins swing may be used as a parameter in water quality monitoring.

malathion;chlorothalonil;zebrafish;behavioral changes

2015-05-28 录用日期:2015-07-20

1673-5897(2016)1-369-06

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150528003

逯南南,李汝,宋武昌,等.马拉硫磷和百菌清胁迫下斑马鱼行为变化的研究[J].生态毒理学报,2016,11(1):369-374

Lu N N,Li R,Song W C,et al.Study on behavioral change of zebrafish exposed to malathion and chlorothalonil[J].Asian Journal of Ecotoxicology, 2016,11(1):369-374(in Chinese)

山东省自然科学基金项目(ZR2014CP019)；国家水体污染控制与治理科技重大专项“南水北调山东受水区饮用水安全保障技术研究与综合示范”课题(2012ZX07404-003)；直饮水科技惠民示范工程(2013GS370202)

逯南南(1984-),女,工程师,研究方向为饮用水安全评价,E-mail:nanwang316@163.com

),E-mail:jiaruibao68@126.com

简介:贾瑞宝(1968—)，男，工学博士，研究员，主要研究方向饮用水安全保障，发表学术论文数十篇。