王增良，杨　欢

(临汾市疾病预防控制中心，山西临汾　041000)

277例手足口病样本病原学检测报告

王增良，杨欢

(临汾市疾病预防控制中心，山西临汾041000)

目的:了解2015年临汾市手足口病病原学特征，为手足口病防控提供病原学依据。方法:使用Realtime PCR检测方法对肠道病毒进行核酸检测和型别鉴定，并对未能分型的肠道病毒的VP2基因片段进行PCR扩增，并对其进行测序和比对鉴定，得出病毒型别。结果:277例手足口病临床诊断病例中，检测到肠道病毒核酸阳性201例，阳性率为71.6%，其中，肠道病毒71型7例，占阳性样本3.5%;柯萨奇病毒A16型62例，占阳性样本30.8%;CA6型94例，占阳性样本46.8%;CA10型3例，占阳性样本1.5%;柯萨奇病毒B5型1例，占阳性样本0.5%;埃可病毒9型1例，占阳性样本0.5%;CA4/CA6混合型2例，占阳性样本1%;未分型肠道病毒(EV)33例，占阳性样本16.4%。结论:2015年临汾市手足口病流行的病原体主要是CA6型，其次是CA16和其他未分型肠道病毒。

手足口病;病原学;肠道病毒;CoxA 6

手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒感染引起，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征的儿童常见传染病。HFMD由肠道病毒EV71型和柯萨奇病毒A4、A5、A7、 A9、A10、A16、B2、B3、B4、B5、B7等多种病毒引起［1］。为探讨2015年临汾市手足口病病原学特征，提供防控手足口病的病原学依据，收集2015年临汾市手足口病临床诊断病例样本277例，进行了病原学检测，现将检测结果报告如下。

1　材料与方法

1.1病例来源

277例病例样本来源于临汾市各县区哨点监测医院首次就诊的HFMD病例，其诊断和分类参照国家《手足口病诊断指南》(2010版)病例定义。

1.2样本采集

按照《手足口病预防控制指南》(2009版)要求，采集2015年全年手足口病临床诊断病例样本277例，其中，咽拭子标本219份，粪便样本58份，均来自于不同的病例。采集样本保存于2～3 mL储存液中，4℃运输至实验室后，24 h内完成荧光定量PCR检测，剩余样本分装保存于－80℃冰箱用于后续检测。

1.3肠道病毒Real-time PCR检测

用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen公司)进行病毒RNA提取。使用肠道通用型EV、EV71、CA16、CA6、CA10等荧光定量PCR检测试剂盒(江苏硕世公司)进行病原学检测，结果判读参考试剂盒说明书。肠道病毒通用型核酸阳性EV，而已有病毒类型核酸检测不能分型者，为未知型。

1.4未知型肠道病毒的VP2基因片段的PCR扩增及序列测定

对未知型样本做进一步分型。参考美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中肠道病毒基因组，针对未知型肠道病毒VP2基因组的部分片段(长度为794bp，与NCBI编号为HE572907的VP1序列相对参考位置为58bp-851bp)设计特异性引物，上游引物为601F(5`-3`):ATATC(C/T)CGGGTGACCGCAGC，下游引物为607R(5`-3`):TC(G/A)GTTGCAGTGTTAG(T/ C)TATTGTTTG;使用One Step RT－PCR Kit(Qiagen公司)进行RT－PCR检测，使用QIAxcel毛细管电泳仪(Qiagen公司)对扩增产物进行分析。扩增产物由梓熙生物公司进行双向测序。将测序结果提交NCBI数据库进行BLAST比对复核。

1.5统计学方法

统计结果使用Micrsoft Excel 2007建立数据库，使用SPSS 15.0软件进行统计学差异分析，计数资料用百分率表示，组间比较用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1病原学监测

277例手足口病临床诊断病例标本，经用荧光定量PCR检测，并对未知型样本再用VP2分型方法进行型别鉴定，结果肠道病毒阳性样本201例，阳性率为71.6%。肠道病毒型别鉴定结果分别为肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)7例，占阳性样本3.5%;柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)62例，占阳性样本30.8%;CA6型94例，占阳性样本46.8%;CA10型3例，占阳性样本1.5%;柯萨奇病毒B5型(Coxsackievirus B5，CB5)1例，占阳性样本0.5%;埃可病毒9型(Echo9)1例，占阳性样本0.5%;CA4/CA6混合型2例，占阳性样本1%;未分型肠道病毒(EV)33例，占阳性样本16.4%。

2.2不同性质标本肠道病毒检出情况

277份样本中，咽拭子标本219份，粪便标本58份。在219份咽拭子标本中，检测出肠道病毒核酸阳性148份，阳性率67.6%。在58份粪便标本中，检测出肠道病毒核酸阳性53份，阳性率91.4%。粪便样本阳性检出率(91.4%)高于咽拭子样本阳性检出率(67.6%)(χ2=13.2，P＜0.05)，差异具有统计学意义。见表1。

表1　不同性质标本肠道病毒检出情况n(%)

2.3人群分布

收集的277例样本中，男155例，肠道病毒阳性118例，阳性检出率76.1%;女122例，肠道病毒阳性83例，阳性检出率68%，男女比例:1.27∶1，差异无统计学意义(χ2=2.31，P＞0.05)。检测出的201例阳性样本中，手足口病患者年龄最小5个月，最大28岁，在0～3岁年龄组182例;其他年龄组19例。见表2、表3。

表2　不同性别患者阳性检出率n(%)

表3　不同性别患者阳性检出率n(%)

2.4时间分布统计

201份阳性样本中，4～7月检测的HFMD肠道病毒阳性数量最高，呈现夏季高发特点。4月份起检测阳性数开始上升，5～7月份呈现一个明显高峰，8月份阳性检测数开始有所下降。见图1。

图1　2015年HFMD检测阳性份数时间分布图

3　讨论

277例手足口病病例样本的EV型别鉴定结果，以肠道病毒CA6型阳性率为最高，阳性率33.9%(94/ 277)，其次，为肠道病毒CA16型，阳性率22.4%(62/ 277)。据报道，2012年以来，肠道病毒CA6型逐渐成为中国大陆HFMD的重要病原，其曾在欧洲和东南亚等世界多地引起过暴发流行［2］。这与本次检测结果相一致。

我国HFMD易感人群多为5岁以下儿童，男性发病率高于女性。HFMD发病高峰期主要为每年的3～7月［3］。从表3、表4和图1可看出，在201例阳性样本中，男性118例，女性83例。0～3岁年龄阳性检出率较高。阳性检出例数3～7月较多。与报道基本相同。

本次监测还发现了EV71和A16型以外的其他型别，包括CA6型，CA10型，柯萨奇病毒B5型，埃可病毒9型，CA4/CA6混合型等。这几种病原型别，在山西省地区未见有报道。不同种类的人肠道病毒所引起的HFMD症状有所不同，且严重程度及病情进展也不完全相同，而至今尚无有效疫苗［4］。近年来，许多国家都报道了由EV71和CA16型以外的其他肠道病毒引起HFMD爆发的疫情，且由其他肠道病毒引起的患者容易发生并发症，如脱甲症、脱皮现象等［5］。这就提示，引起HFMD病毒型别是在不断变化的，在今后HFMD的防控工作中，要注意，有可能会出现新的肠道病毒来取代原有的病毒。因此，做好对HFMD病原的检测，掌握引起HFMD的肠道病毒型别分布和构成，从源头上主动对HFMD进行预防和控制，显得尤为重要。

［1］刘克洲，陈智.人类病毒性疾病［M］.北京:人民卫生出版社，2010.

［2］曾汉日，陆靖，李晖，等.广东省2008－2009年柯萨奇A6型肠道病毒的流行及其基因特征分析［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2014，34(10):742-746.

［3］胡跃华，肖革新，郭莹，等.中国大陆手足口病流行特征分析［J］.中华疾病控制杂志，2014，8(18):693-697，747.

［4］林虹，马江涛，陈慧，等.宁夏回族自治区2013－2014年手足口病病原学分析［J］.中国公共卫生，2015，31(11):1489-1492.

［5］王作梅，王淑珍，李俊红，等.82例成人手足口病的临床特点分析［J］.现代生物医学进展，2012，12(27):5363-5365.

本文编辑:王知平

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1671-0126(2016)02-0023-03

王增良，男，副主任技师，从事疾病预防检验工作