朱红娜　乔瑛　苏安乐　张婷　柏凌　梁厚成

1.西安市第一医院眼科,陕西西安710002；2.西安交通大学第二附属医院眼科,陕西西安710004

蓝光照射人视网膜色素上皮细胞后通过增加细胞内钙离子浓度促进凋亡的机制

朱红娜1乔瑛1苏安乐1张婷1柏凌2梁厚成1

1.西安市第一医院眼科,陕西西安710002；2.西安交通大学第二附属医院眼科,陕西西安710004

目的观察蓝光对人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。方法细胞株分为蓝光照射组和对照组。蓝光照射组,利用35 W白色冷光灯加用蓝色滤光片建立蓝光损伤体外培养的RPE细胞模型,蓝光控制波长范围470～520 nm,光照强度在2000 lx左右,光照时间24～96 h,实验过程中保证光照在细胞培养孵箱内密进行。对照组为常规避光孵箱培养细胞,除无光线照射外,各培养条件相同。利用流式细胞仪检测RPE细胞的凋亡变化,利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测RPE细胞内游离钙离子浓度。结果与对照组比较,蓝光照射组的RPE细胞凋亡增加（P＜0.05)；照射组的RPE细胞内游离钙离子浓度增加（P＜0.05)；通过特异性抑制L型电压依赖性钙离子通道功能降低RPE细胞内游离钙离子浓度,在一定程度上降低了蓝光引起的RPE细胞凋亡。结论蓝光可以通过增加RPE细胞内游离钙离子浓度促进RPE细胞的凋亡,L型电压依赖性钙离子通道有望成为治疗年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病的新靶点。

蓝光;人视网膜色素上皮细胞;凋亡;细胞内钙离子浓度

年龄相关性黄斑变性的病发病机制复杂,目前尚未完全阐明且疗效欠佳,是引起中老年人发生视力缺损甚至致盲的主要疾病之一[1-2]。因此,研究年龄相关性黄斑变性的发病机制有重要意义。年龄相关性黄斑变性与视网膜光损伤有相似的病理过程,视网膜光损伤是研究年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病的良好模型[3]。已有研究证实,光损伤过程中,视网膜色素上皮细胞的凋亡增加,且损伤程度和光暴露的剂量成正比,但其具体机制还未阐明[4-5]。近年来大量文献报道,作为重要的第二信使,细胞内钙离子浓度对参与调控细胞的增殖、分化、矿化、自噬和凋亡等过程,而钙离子通过L型电压依赖性钙离子通道进入细胞是钙离子进入RPE细胞的主要方式[6-7]。本研究通过蓝光照射体外培养的人视网膜色素上皮细胞,检测其凋亡水平的变化及细胞内钙离子水平,以探究光暴露对人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响和可能的机制,旨在为年龄相关性黄斑变性等视网膜变性疾病发病机制的研究提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19细胞株)购自美国模式菌种收集中心（ATCC)；DMEM细胞培养基、PBS、胰蛋白酶和双抗等细胞培养试剂（美国hyclone公司)；胎牛血清（中国四季青公司)；流式细胞仪（美国B&D公司)；激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP5)；荧光标记钙离子探针Fluo-3AM（中国碧云天公司)；L型钙离子通道阻断剂nifedipine（以色列Alomone Lab公司)；Annexin-V/PI凋亡试剂盒（美国Roche公司)；其他耗材及试剂均购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养常规方法复苏、培养细胞,所用试剂如上所述,取5～10代ARPE-19细胞株用于实验。参照蔡善君等[5]建模方法,去上述5～10代的ARPE-19细胞株常规培养,待细胞汇合度达80%左右时进行蓝光照射。光照条件为35 W白色冷光灯加用蓝色滤光片,控制波长范围470～520 nm,光照强度在2000 lx左右,光照时间从24～96 h。

1.2.2人视网膜色素上皮细胞凋亡检测将分组处理过的细胞用预冷的PBS清洗3遍,胰蛋白酶消化收集细胞,再用预冷的PBS清洗2遍；随后利用Binding Buffer缓冲液制备1×106个细胞的细胞悬液；在上述细胞悬液中加入5 μg Annexin V试剂,吹打均匀后,室温反应10 min；加入5 μL Annexin V-FITC和/或PI,轻轻混匀,室温避光放置15 min[8-9]。实验重复至少3次。

1.2.3钙离子成像检测RPE细胞内钙离子浓度利用Fluo-3AM对RPE细胞内游离钙离子浓度进行检测。将处理后培养在6孔板中的细胞取出后,配制细胞冲洗液进行细胞洗涤,常规孵箱中孵育35 min。随后用细胞冲洗液洗涤2次,再次孵箱孵育10 min。用激光共聚焦显微镜观察,发射波长为525 nm,激发波长为488 nm。在随即视野中选取50个细胞扫描其Ca2+的荧光强度并用FV10-ASW1.7 Viewer软件进行分析[10]。实验重复至少3次。

1.2.4流式细胞仪检测RPE细胞内钙离子浓度将培养的RPE细胞用0.25%的胰蛋白酶消化并制备成单细胞悬液,Fluo-3AM对RPE细胞内钙离子标记方法同上,最后制成1×106个/mL的细胞悬液,上流式细胞仪检测。激发条件同上。利用BD公司的BD FACSDiva和BECKMAN公司EXPO32软件对测得的荧光强度及细胞的阳性率进行分析[7]。每组检测的细胞量在10000个以上,实验重复至少3次。

1.2.5nifedipine孵育RPE细胞利用二甲基亚砜将购得的L型钙离子通道阻断剂nifedipine粉末配成10 mmol/L的浓缩溶剂,在培养细胞时再利用正常细胞培养基将此浓缩液稀释为工作浓度10 μmol/L。蓝光照射组细胞保证在蓝光照射下在培养孵箱内培养；蓝光照射+nifedipine组为蓝光照射的同时利用上述配制的工作液培养细胞；对照组为常规避光孵箱培养细胞,除无光线照射外,各培养条件同蓝光照射组。

1.3统计学方法

采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差（±s)表示,两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

图1　流式细胞仪检测蓝光照射对RPE细胞凋亡的影响

2.1蓝光照射促进RPE细胞凋亡

研究组先利用Annexin V/PI凋亡试剂盒将细胞进行染色处理,随后利用流式细胞仪检测蓝光照射后RPE细胞的凋亡变化,发现与对照组相比,蓝光照射后RPE细胞凋亡明显增加（P＜0.05)。见图1。

2.2蓝光照射增加RPE细胞内钙离子浓度

为了验证蓝光照射后RPE细胞凋亡和RPE细胞内钙离子浓度的关系,采用Fluo-3AM标记RPE细胞内钙离子,在共聚焦显微镜下检测蓝光照射对RPE细胞内游离钙离子的影响。与对照组比较,蓝光照射组荧光强度增高。定量比较结果表明,蓝光照射后RPE细胞内钙离子浓度是对照组RPE细胞内钙离子浓度的2.5倍（P＜0.05)（图2a)。流式细胞仪来检测蓝光对RPE细胞内游离钙离子浓度的影响,结果表明:与对照组比较,蓝光照射组荧光强度增高（P＜0.05)（图2b)。

2.3nifedipine可以减少蓝光照射引起的RPE细胞凋亡

在蓝光照射时在培养基中加入10 μmol/L的nifedipine,在处理后利用流式细胞仪检测各组RPE细胞凋亡情况。与对照组比较,蓝光照射组RPE细胞凋亡明显增加（P＜0.05)；与蓝光照射组比较,蓝光照射+nifedipine组RPE细胞凋亡减少（P＜0.05),但与对照组比较,其凋亡增加（P＜0.05)。见图3。

图2　蓝光照射对RPE细胞内游离钙离子浓度的影响

图3　蓝光条件下检测降低RPE细胞内钙离子浓度对RPE细胞凋亡的影响

3　讨论

年龄相关性黄斑变性是引起中老年人发生视力缺损的主要疾病之一,该病的发生发展与长期累积的光暴露损伤相关[11]。人视网膜色素上皮细胞具有视色素转运,转运营养成分和清除自由基等功能,RPE细胞功能的正常对维持视网膜的功能和结构有重要意义[4,12]。已有研究证实,光损伤过程中,视网膜色素上皮细胞的有不同程度的损伤,蔡莉等[4]发现蓝光对RPE细胞的损伤呈光照强度及光照时间依赖性。本实验观察到蓝光照射后RPE的凋亡明显增加,这与之前研究相符。

近年来大量文献报道,作为重要的第二信使,细胞内钙离子浓度对参与调控细胞的增殖、分化、矿化、自噬和凋亡等过程。细胞内正常浓度的钙离子对于细胞各项活动的维持至关重要。在高糖、缺氧和某些药物等刺激因素存在时,细胞内钙离子浓度增加,引起钙超载,从而促进细胞的凋亡[13-16]。在本实验中,本研究组经过钙离子敏感的荧光染料Fluo-3AM的预染,经过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪的检测发现,蓝光照射后,RPE细胞内游离钙离子浓度明显增加,且在蓝光照射的整个过程和检测过程中,RPE细胞内的钙离子浓度持续保持高水平。细胞内的游离钙离子的来源有两个,细胞外钙离子通过离子通道进入细胞内,细胞内的钙库释放,但内钙的释放主要是以脉冲的形式,短时间内使得细胞内钙离子浓度发生大幅度的增加[17-18]；而细胞外的钙离子主要是通过细胞表面的L型电压依赖型钙离子通道进入细胞[19-21]。为了进一步验证蓝光照射引起RPE细胞凋亡增加和RPE细胞内钙离子浓度高水平的关系,研究组在蓝光照射的同时加用特异性L型电压依赖型钙离子通道阻滞剂nifedipine,发现虽然没有恢复正常对照水平,但蓝光照射引起RPE细胞凋亡减少。这说明阻断RPE细胞上L型电压依赖型钙离子通道,降低其细胞内游离钙离子浓度,能够减少蓝光对RPE细胞凋亡的促进作用,发挥一定的保护作用。

尽管如此,本研究也存在一些不足之处:实验只是离体验证了蓝光对RPE细胞凋亡的影响及初步探讨了可能的机制,并未在动物模型中验证结论,在接下来的实验中,研究组将致力于克服在体观察RPE细胞凋亡及细胞内钙离子浓度等技术难题,在动物模型中验证本研究的结论；蓝光照射引起RPE细胞凋亡增加的其他原因和光暴露对RPE细胞内游离钙离子浓度升高的原因仍有待进一步研究与探索。

综上所述,蓝光可以通过增加RPE细胞内游离钙离子浓度促进RPE细胞的凋亡,本实验从光化学损伤促进RPE细胞凋亡的角度,探讨了光暴露对RPE细胞凋亡的影响,一定程度上对治疗蓝光损害视网膜眼病提供了指导意义。

[1]Klettner A.Age-related macular degeneration-biology and treatment[J].Med Monatsschr Pharm,2015,38（7):258-266.

[2]梁山,梁云,申国彦.维生素A缺乏易致老年黄斑变性的实验研究[J].中国医药导报,2008,5（24):32-33.

[3]Yam JC,Kwok AK.Ultraviolet light and ocular diseases[J]. Int Ophthalmol,2014,34（2):383-400.

[4]蔡莉,易敬林.视网膜色素上皮细胞损伤机制研究进展[J].眼科新进展,2012,32（9):898-900.

[5]蔡善君,严密,张军军.蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡[J].中华眼底病杂志,2005,21（6):384-387.

[6]Bhosale G,Sharpe JA,Sundier SY,et al.Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell death[J].Ann NY Acad Sci,2015,1350:107-116.

[7]Ayaz O,Howlett SE.Testosterone modulates cardiac contraction and calcium homeostasis:cellular and molecular mechanisms[J].Biol Sex Differ,2015,6:9.

[8]李上海,梁伟钧,王苗.辛伐他汀对缺血再灌注损伤下内皮祖细胞凋亡的影响[J].中国医药导报,2015,12（19): 11-14.

[9]武晓,刘凤娟,王鹏飞,等.巴豆生物碱对肺腺癌细胞凋亡的影响及机制研究[J].中国医药导报,2016,13（1):17-20.

[10]Sun Z,Cao X,Zhang Z,et al.Simulated microgravity inhibits L-type calcium channel currents partially by the up-regulation of miR-103 in MC3T3-E1 osteoblasts[J]. Scientific Reports,2015,5:8077.

[11]Zarbin M.Cell-Based Therapy for Degenerative Retinal Disease[J].Trends Mol Med,2016,22（2):115-134.

[12]Han S,Lu Q,Wang N.Apr3 accelerates the senescence of human retinal pigment epithelial cells[J].Mol Med Rep, 2016,13（4):3121-3126.

[13]赵小祺,王春光,王小荣,等.缺氧诱发细胞凋亡的机制[J].中国老年学杂志,2010,30（7):1012-1014.

[14]齐娜,廖迎,张贵林.心肌缺血再灌注损伤及药物治疗研究进展[J].华夏医学,2007,20（1):170-172.

[15]Kistamas K,Szentandrassy N,Hegyi B,et al.Changes in intracellular calcium concentration influence beat-tobeat variability of action potential duration in canine ventricular myocytes[J].J Physiol Pharmacol,2015,66（1): 73-81.

[16]Dong XJ,Luo XD,Xiong L,et al.Effects of energy controllable steep pulses on intracellular calcium concentration and cell membrane potential[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18（5):680-688.

[17]王健,庞军涛.不同剂量辛伐他汀对慢性心房重构犬心房肌细胞内游离钙离子浓度的影响[J].中国医药导报, 2014,11（3):36-38.

[18]黄汉辉,郑师明,荆冬冬,等替米沙坦对血管紧张素Ⅱ所致血管内皮细胞游离钙离子的抑制作用[J].中国医药导报,2015,12（3):11-14.

[19]孙中洋,李东韬,张舒.成骨细胞钾、钙离子通道的研究进展[J].解放军医学院学报,2014,35（2):186-189.

[20]黄鹤飞,陈颖,蔡维艳,等.芍药苷对大鼠背根神经无细胞内Ca2+的影响[J].中国实验动物学报,2016,24（1): 25-30.

[21]唐晓琼,邓华聪,万青,等.2型糖尿病患者细胞内钙离子浓度变化的研究[J].重庆医科大学学报,2002,27（2): 133-135.

Blue light promotes apoptosis of human retinal pigment epithelial cells by up-regulation of intracellular calcium concentration

ZHU Hongna1QIAO Ying1SU Anle1ZHANG Ting1BO Ling2LIANG Houcheng1
1.Department of Ophthalmology,Xi'an First Hospital,Shaanxi Province,Xi'an710002,China;2.Department of Ophthalmology,the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province,Xi'an710004,China

Objective To investigate the influence and mechanism of blue light on the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells.Methods Cells were divided into blue light group and control group.35 W white light lamp with blue filter was used to establish damaged RPE cell model in vitro,blue ray wave length ranged 470-520 nm,and the light intensity was about 2000 lx,light exposure time was set to 24-96 h,in the experimental process,the light was carried out in the cell culture incubation box.The control group cells were cultured in the conventional light avoidance incubator,and the culture conditions were as the same as the blue light group except without light.After exposure to blue light,the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells was tested by flow cytometry.And then the intracellular calcium concentration of human retinal pigment epithelial cells was measured by flow cytometry and laser scanning confocal microscope.Results Compared with control group,the apoptosis of human retinal pigment epithelial cells increased in blue light group(P＜0.05),and the intracellular calcium concentration of human retinal pigment epithelial cells increased(P＜0.05).The intracellular calcium concentration of human RPE cells decreased by specific inhibition of L-type voltage-dependent calcium channel,RPE cell apoptosis caused by blue light decreased.Conclusion Blue light promotes apoptosis of human retinal pigment epithelial cells by the up-regulation of intracellular calcium concentration. [Key words]Blue light;Human retinal pigment epithelial cells;Apoptosis;Intracellular calcium concentration

R774.1

A

1673-7210(2016)06(b)-0004-04

国家自然科学基金资助项目（30901644)。

信息]朱红娜（1983.10-),硕士；研究方向:眼底病学。

梁厚成（1963.1-),博士,主任医师；研究方向:眼底病学。

（2016-03-16本文编辑:苏畅)