邢 飞, 张志想, 陈 策, 王红清, 李世访*

(1.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193;2. 中国农业大学园艺学院, 北京 100193)



北京平谷区苹果锈果类病毒检测初报

邢 飞1,2, 张志想1, 陈 策1, 王红清2, 李世访1*

(1.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193;2. 中国农业大学园艺学院, 北京 100193)

采集北京市平谷区‘中秋王’、‘寒富’苹果叶片样品共12份,以Northern杂交、RT-PCR方法检测苹果锈果类病毒(Applescarskinviroid, ASSVd)带毒情况。结果表明,表现明显锈果症状的‘中秋王’样品均检出ASSVd,无明显症状的‘中秋王’样品没有检出ASSVd,而无明显症状的‘寒富’样品全部携带ASSVd。测序发现,所得序列与NCBI中已报道的ASSVd基因组序列相似性为91%～99%,且两品种中ASSVd主流序列完全相同。结果说明‘中秋王’对ASSVd较为敏感,感病后易于表现出明显的锈果症状;‘寒富’对ASSVd耐性较强,感病后不表现出明显症状。

苹果锈果病; 苹果锈果类病毒; 品种

苹果锈果病是我国苹果生产中的重要病害,其病原为苹果锈果类病毒(Appleskinscarviroid,ASSVd)。ASSVd属于马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),一般包含329～331个核苷酸,具有中央保守区但没有核酶活性,在细胞核内进行非对称式滚环复制[1-2]。ASSVd可系统侵染包括苹果[3]、梨[4]、樱桃[5]等在内的多种果树,一旦侵染,果树将终生带毒,给产业发展造成严重的经济损失。ASSVd侵染苹果后通常表现锈果型、花脸型、锈果-花脸混合型、环斑型和绿点型等症状[6-7]。该类病毒主要通过带毒苗木或接穗、修剪工具等方式传播,尚无虫媒传播该病毒的报道[1, 7-8]。由于类病毒不编码任何蛋白质,故无法通过血清学方法检测ASSVd。目前,ASSVd的检测方法主要有生物学鉴定和分子生物学检测。其中,生物学鉴定耗时长、特异性较差、工作量较大;而分子生物学具有较高的灵敏度、特异性强、检测迅速,可用于大量样品的检测,主要包括核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应等[9]。

北京平谷区苹果栽培面积逐年扩大,成为带动地区经济发展的支柱产业之一。近年来,该区一些果园苹果锈果病发生严重,使得果实产量和品质大幅下降,经济效益受到影响。为此,我们初步调查了一苹果锈果病发生严重的果园,采集样品后利用分子生物学手段进行检测,旨在为田间苹果生产栽培提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

2015年7-8月,在北京平谷区山东庄镇平谷区果品产业协会实验示范基地一苹果园分别从12株12年生的苹果树上随机采集果实表现明显锈果的‘中秋王’叶片及不表现明显症状的‘中秋王’和‘寒富’叶片样品,共计12份。其中,‘中秋王’样品3份表现锈果症状,2份无明显症状;‘寒富’样品7份均无明显症状。苹果栽培南北走向, 1 m×3 m株行距密植栽培,篱壁式修剪。

1.2 总RNA提取及反转录

叶片总RNA提取参考Zhang等[10]的方法。反转录体系如下：5×M-MLV buffer 4 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,10 μmol/L random primer 0.5 μL,10 μmol/L oligodT 0.5 μL,RNase inhibitor 0.5 μL,M-MLV reverse transcriptase 0.5 μL,总RNA 2 μL,补充DEPC 处理H2O至20 μL。42℃反应1 h,取出冰上放置5 min后,直接用于PCR反应模板或贮存于-20℃备用。

1.3 Northern杂交检测

使用1×MOPS缓冲液制备含1.1%甲醛的1.5%的琼脂糖凝胶,并把15 μL RNA原液与2 μL 10×loading buffer混合液加入点样孔,100 V恒压电泳,直至溴酚蓝条带迁移到凝胶中部,停止电泳,用真空转印仪转膜30 min,紫外交联固定。预杂交、杂交及显色反应按地高辛标记检测试剂盒(Roche)说明书进行。杂交所用阴性和阳性对照分别为本实验室前期提取的苹果叶片健康样品和ASSVd感病样品的总RNA。

1.4 PCR检测

PCR扩增体系：2×pfuPCR mix 12.5 μL,10 μmol/L上游引物(5′-CCGGTGAGAAAGGAGCTGCCAGCA-3′)0.5 μL,10 μmol/L下游引物(5′-CCTTCGTCGACGACGACAGGTGAGT-3′)0.5 μL,cDNA模板1.5 μL,补水至25 μL。反应程序：94℃预变性4 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃再延伸10 min。

1.5 PCR产物回收及克隆

PCR产物回收：PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳后,紫外灯下快速切胶、回收。回收步骤参照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(康宁生命科学有限公司)说明书进行。

克隆：参照零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)说明书进行。PCR产物经胶回收后连接到pTOPO-Blunt载体上,并转化DH5α感受态细胞,37℃过夜培养,挑选单克隆培养后进行菌液PCR鉴定,并把阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 田间调查

调查发现,该果园主栽苹果品种以‘中秋王’和‘寒富’为主,接穗由山西、河北、吉林等地引进。在表现苹果锈果病症状的品种中,以‘中秋王’最为突出,其果面锈果症状严重,并伴随明显裂果症状(图1a～b,封面)。‘中秋王’接穗2003年引进时无明显症状,2012年始有苹果锈果症状,2015年大发生。初步调查了160株‘中秋王’苹果树,其中有40株的果实表现锈果症状。不同的是,同一果园邻近栽培的‘寒富’果实表面并无明显锈果症状(图1c)。

图1 平谷苹果果实症状Fig.1 Symptoms of apple fruits in an orchard of Pinggu District

2.2 Northern杂交和RT-PCR检测ASSVd

Northern杂交结果显示(图2a),表现锈果症状的‘中秋王’叶片(1、2、12)中均呈ASSVd阳性,无明显症状样品(3、11)则没有检测到ASSVd。在不表现明显症状的‘寒富’样品(4～10)中均能检测到ASSVd,且检出率高达100%。

为进一步对上述结果加以确认,利用灵敏度更高的RT-PCR方法检测样品中ASSVd。结果显示(图2b),在表现锈果症状的‘中秋王’样品(1、2、12)和无明显症状的‘寒富’样品(4～10)中均检测到ASSVd,无明显症状的‘中秋王’样品中ASSVd检测呈阴性(3、11),结果同Northern杂交结果一致。说明对于样品的ASSVd检测结果较为可信。

2.3 ASSVd序列测定及 RNA二级结构预测分析

对ASSVd阳性样品1(‘中秋王’)和5(‘寒富’)分别测得4个单克隆序列,结果表明,所得序列全长为331 bp,与NCBI中已登录的ASSVd基因组序列相似性为91% ～99%。此外,分析了测得的8条序列,其中有6条序列完全相同(作为样品的主流序列),另2条分别有一个碱基差异。

图2 Northern杂交和RT-PCR检测苹果叶片中ASSVdFig.2 Northern blot and RT-PCR analysis of ASSVd in cultivated apple leaves

对样品中主流序列的二级结构进行预测,结果显示该主流序列具有Pospiviroidae基因组二级结构典型特征,包括5个结构功能区,分别为左末端区(TL)、致病区(P)、中央保守区(C)、可变区(V)和右末端区(TR),能够形成稳定的拟棒状结构。另外,比对了该序列与ASSVd参考序列(NC_001340.1),发现两者核酸序列相似性达98%。本试验所得序列在8个位点发生了碱基突变,分别在V区的125位和126位之间、C区的219位和220位之间插入碱基G、U,以及TL区的G1→C、U3→ G、A4→ U、U300→ A、A319→ U和C区的G249→ U(图3)。

图3 平谷苹果中ASSVd核酸序列及其二级结构预测Fig.3 The nucleotide sequences and secondary structure of ASSVd from Pinggu

3 讨论

苹果锈果病是危害苹果产业健康发展的重要病害,在国内,陈炜等首次在表现锈果的苹果组织中检测到了环状类病毒RNA,并进行了侵染性研究,为锈果病类病毒病原提供了证据[11-12]。本试验应用灵敏度较高的探针杂交并结合RT-PCR分子生物学方法检测了‘中秋王’和‘寒富’两个苹果品种的ASSVd侵染情况。结果表明,‘中秋王’和‘寒富’两个品种对ASSVd的敏感性不同,而且‘中秋王’果实锈果症状与ASSVd检出情况呈现明显的相关性。序列比对后发现,侵染两个苹果品种的ASSVd主流序列完全相同,但在果实表面引起的症状完全不同。这可能说明了ASSVd侵染引起了部分品种的寄主植物中某些特定基因表达水平的变化,最终导致细胞组织发生病变,寄主植物表现出特有的症状。

另外,我们也分析了ASSVd主流核酸序列的二级结构及其变异情况,主流序列的碱基变异主要发生在TL区。在C区也有一个碱基的变异和插入,第249位的G颠换为U,219位和220位之间插入碱基U,以及V区125位和126位之间也有一个碱基G插入。但是C区和V区中三个位点突变后的碱基与首次公布的ASSVd序列日本分离物(Y00435.1)碱基完全相同[13]。之后,比对该主流序列与日本分离物序列发现,两序列C区碱基完全相同,仅在TL区和V区有6个碱基的差异。这说明本试验所得ASSVd主流序列比较接近日本分离物。虽然碱基突变可能引起病毒复制或致病能力的不同[14],但本试验所测样品(1和5)主流序列的一致性说明了序列变异并非是引起‘中秋王’和‘寒富’果实表现不同症状的直接原因。

总体上,试验结果说明了苹果品种抗性的强弱可能是致使‘中秋王’和‘寒富’果实是否表现锈果症状的重要因素。因此,选育抗病、耐病苹果品种对于苹果锈果病的防控具有重要作用。然而,ASSVd侵染‘中秋王’、‘寒富’后表现不同症状的致病机理尚有待进一步研究。

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(责任编辑：杨明丽)

Detection of Apple scar skin viroid in apple leaves from Pinggu District in Beijing

Xing Fei1,2, Zhang Zhixiang1, Chen Ce1, Wang Hongqing2, Li Shifang1

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. College of Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

Twelve ‘Zhongqiuwang’ and ‘Hanfu’ apple leaf samples were collected from Pinggu District, Beijing, China, andApplescarskinviroid(ASSVd) was detected in these samples using Northern blot and RT-PCR. The results showed that symptomatic ‘Zhongqiuwang’ and asymptomatic ‘Hanfu’ samples were infected by ASSVd, while no ASSVd was detected in asymptomatic ‘Zhongqiuwang’ samples. Sequencing analysis showed that the obtained ASSVd sequences had 91%-99% similarities with other ASSVd sequences in the NCBI, and the dominant sequences of ASSVd from ‘Zhongqiuwang’ and ‘Hanfu’ were the same. Our results demonstrated that ‘Zhongqiuwang’ seems to be susceptible and sensitive to ASSVd, and ‘Hanfu’ showed a relatively strong tolerance to ASSVd.

apple scar skin disease;Applescarskinviroid; variety

2016-03-15

2016-04-06

国家自然科学基金(31471747)；公益性行业(农业)科研专项(201203076)

S 436.611

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.025

* 通信作者 E-mail:sfli@ippcaas.cn