马宇欣, 李世访

(中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)



特约稿件

高通量测序技术在鉴定木本植物双生病毒中的应用

马宇欣, 李世访*

(中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193)

高通量测序技术(next-generation sequencing, NGS)平台提供了一种高效、快速、低成本、深度测序DNA的解决方案,2009年该技术开始被应用于植物病毒学领域,包括新病毒的发现,病害病原的鉴定,病毒基因组多样性及进化的研究,显著加快了植物病毒学的发展进程。迄今,应用高通量测序技术已经成功鉴定了上百种新的植物病毒和类病毒。双生病毒是一类对多种作物造成毁灭性危害的DNA病毒,多发生于草本作物。然而利用高通量测序技术,从柑橘、葡萄、苹果和桑树等多种多年生木本植物中检测到了新的双生病毒,显示出了高通量测序技术所独有的、传统检测技术所不具备的优势。本文围绕高通量测度技术在植物病毒学领域的应用进行概述,重点阐述NGS用于检测木本植物双生病毒的几个实例。

高通量测序; 双生病毒; 植物病毒诊断; 木本植物

1 高通量测序技术

1.1 高通量测序平台的建立及应用

2005年,传统的桑格测序技术 (Sanger sequencing)遭遇了革命性的冲击,更准确、更快速的高通量测序技术诞生了[1]。美国罗氏公司的Roche 454测序平台的推出,开创了高通量测序的先河,此后,美国Illumina公司和ABI公司相继推出Solexa[2]和SOLiD[3-4]测序技术。高通量测序技术的诞生是基因组学领域一个具有里程碑意义的事件[5-7],为现代生命科学的研究提供了前所未有的机遇[8]。

与传统的桑格测序相比,高通量测序技术在测序速度和通量上有了巨大提高,测序成本也大大降低。以人类基因组计划为例,2001年,人类基因组草图发表,宣告人类基因组计划初步完成,这项研究耗时15年,花费了近30亿美元[9]。而如今应用最新的HiSeq X 测序平台,能够在一天内测序45个人类基因组,并且每个基因组测序仅需1 000美元。相比传统测序方法有了量的提高和质的飞跃,这将推动更多物种遗传信息的解密,跨入基因组信息的大数据时代。

目前,高通量测序技术在分子生物学领域的应用包括:全基因组测序 (whole-genome sequencing)[10-12],外显子组测序 (exome sequencing)[13-14],目标区域测序 (targeted regions sequencing, TRS),未知基因组的从头测序 (denovosequencing),总RNA和mRNA测序 (RNA-Seq),小RNA和非编码RNA测序[15],以及表观基因组学领域的DNA甲基化测序[16],核糖体图谱和ChiP测序[17]等,为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学的研究提供了重要的数据信息[8]。

1.2 高通量测序平台的比较

在过去的10年里,高通量测序技术平台经历了不断的改进,美国Illumina和Roche等生物科技公司相继推出不同原理、不同应用特性、功能更强大的测序仪,单次测序反应数据量也由2005年的1G增长至1T,提高了1 000倍[18](表1)。依据测序原理的不同,目前常用的测序方法有连接法测序(sequencing by ligation, SBL)及使用合成法测序 (sequencing by synthesis, SBS)的循环可逆终止法(cyclic reversible termination, CRT)和单核糖核酸增加法(single-nucleotide addition, SNA)[19]。对各大测序平台比较发现[19],NGS研究最常用的是Illumina平台, Illumina的产品覆盖了从低通量的Mini-Seq到超高通量的HiSeq X系列,其中HiSeq X系列最多可以在一年内产生1 800多个30×覆盖度的人类基因组数据量。目前Illumina测序仪能测得的最长读长为300 bp,并且运行稳定、数据可靠、性价比高,这些优势决定了其在短读长测序上的广泛应用。Roche 454平台和Ion Torrent平台能够提供较长的读长,大约为700 bp与400 bp,因而在基因组结构较为复杂的研究上应用相对较多,然而与Illumina平台相比,其高昂的费用,低通量等缺点限制了它们的广泛应用。以连接测序法为原理的SOLiD 5500测序平台能够测得75 bp的读长,准确率虽高,但由于读长太短,运行时间太长等硬伤限定了其实用性。同样测序原理的华大基因的BGISEQ-500平台,采用探针锚定聚合技术 (cPAS)能够进行单、双端测序,提供一站式测序体验,测得的最长读长达100 bp,快速、灵活、可拓展是该平台的优势。Qiagen的GeneReader是专为临床诊断设计的,主要应用于肿瘤基因上,应用面较窄(表1)。

表1 第二代测序技术平台的比较[19]1)

Table 1 Comparison of NGS platforms[19]

平台Platform读长/bpReadlength通量/RunThroughput运行时间Runtime错误率/%Errorprofile每Gb费用/＄CostperGb优势Advantage局限性Limitation连接法测序Sequencingbyligation，SBLSOLiD5500Series50/75(SE)160～320Gb～10d≤0．170准确率高读长短运行时间长BGISEQ⁃50050～100(SE，PE)40～200Gb24h≤0．1NA一站式速度快通量高读长短合成法测序Sequencingbysynthesis，SBS⁃循环可逆终止法(Cyclicreversibletermination，CRT)IlluminaMiniSeqHighoutput75～150(PE)1．6～7．7Gb7～24h≤1200～300IlluminaMiSeqv375～300(PE)3．3～15Gb21～56h0．10110～250IlluminaNextSeq500/55075/150(PE)16～120Gb15～29h<140通量高运行速度快费用低性价比高读取高AT或CG富集片段时，错误率高IlluminaHiSeq2500v2Rapidrun50～250(PE)25～150Gb16～60h0．1040～90IlluminaHiSeq250050～125(PE)135～500Gb2．5～11d0．1030～58IlluminaHiSeq3000/400075/150(PE)325～750Gb1～3．5d0．1020～30IlluminaHiSeqX150(PE)800～900Gb<3d0．107QiagenGeneReaderNA12gene；1250mutationsNA400～600/panel全流程平台费用合理应用范围窄

续表1 Table 1(Continued)

平台Platform读长/bpReadlength通量/RunThroughput运行时间Runtime错误率/%Errorprofile每Gb费用/＄CostperGb优势Advantage局限性Limitation合成法测序(Sequencingbysynthesis，SBS)⁃单核糖核酸增加法(Single⁃nucleotideaddition，SNA)454GSJuniorSystem400～1000(SE，PE)35～70Mb10～18h119500～40000读长长精确度高通量低价格昂贵454GSFLX450～1000(SE，PE)450～700Mb10～23h19500～15500IonPGMTMSystem200～400(SE)30Mb～1Gb3～23h125～1000IonProtonTMSystem200(SE)10Gb2～4h180灵活快速费用低单向测序限制其应用IonS5System200～400(SE)600Mb～15Gb2．5～4h1300～2400

1) SE: 单端测序; PE: 双端测序。

SE: Single-end sequencing; PE: Pair-end sequencing.

2 高通量测序技术在植物病毒检测领域的应用

植物病毒病是影响作物生产的重要病害,不同于真菌和细菌病害,病毒病害由于缺少有效的防控药剂,使得其防治十分困难。而且随着国际交流日益频繁,贸易全球化,植物繁殖材料和种子的运输等都会造成病毒和类病毒在国际间迅速传播。因此,尽可能地掌握病毒的发生及分布情况,建立快速、准确的检测技术,做好植物材料入境检验检疫工作,对于植物病毒病害的防控尤为重要。传统的植物病毒检测方法包括:生物学测定法、血清学检测法、电子显微镜检测法、分子生物学检测法等，这些方法在过去的几十年里发挥着巨大作用,是植物病毒检测的有力手段。然而,以上方法的实施必须对病原物有预先的了解,包括基因组结构特性,核酸序列,血清学特性等等,并且耗时较长、灵敏度不高,更加无法有效检测未知的新病毒和类病毒,高通量测序的诞生及其在植物病毒检测方面的应用,克服了上述植物病毒传统检测方法的弊端,带来了检测技术上的革命。

2009年,高通量测序技术开始应用于植物病毒学领域[20-22],包括发现新的病毒及类病毒、鉴定已知病害的病原、分析基因组多样性和进化及病害流行学等[23]。高通量测序技术在未知病毒的发现与鉴定研究中发挥了巨大优势,迄今已鉴定了100种以上新的植物病毒和类病毒[24-27],不仅包括从主要农作物上鉴定的,还包括从野生植物或杂草中鉴定的多种病毒[26,28-29],显著加快了新病毒的发现历程,钱亚娟等[30]曾对高通量测序技术及其在植物病毒发掘中的应用研究和前景进行了详细的概述和展望。

高通量测序技术的高灵敏度及非序列依赖性的优势也被充分应用于植物的进出口检验检疫过程中。例如:2014年,在法国蒙彼利埃,Candresse等[31]利用高通量测序技术从一批进口甘蔗中检测到了一种新的双生病毒-甘蔗白条纹病毒 (Sugarcanewhitestreakvirus, SWSV),然而,常规的检测方法却未能检测到该病毒,躲过了入境检验。与之类似,在美国,利用NGS成功从进口的油桃树中检测到了一种新的黄矮病毒 (Luteovirus)和一种新的玉米雷亚朵非纳病毒 (Marafivirus)[32]。因此,在不久的将来,随着检测成本的降低和技术的进步,高通量测序技术将有可能成为常规的检测技术,应用于植物进出口的检验检疫,显著减少可能蒙混过关的未知病毒的数量,有效控制病毒病在不同区域间的传播和扩散。

3 高通量测序技术检测植物病毒的测序模板

高通量测序技术用于检测植物病毒的主要流程包括:1)样品的制备;2)文库构建;3)上机测序;4)数据分析等[30]。其中,样品的制备过程中核酸的高质量提取是关键步骤,它将直接影响文库的构建,进而影响测序的深度。然而,与寄主植物基因组相比,病毒基因组的含量是极低的,如何高效地提取病毒来源的核酸,以便在测序反应中测得更多来自于病毒本身的序列,这是众多研究者正在探索的问题。尽可能地富集病毒来源的序列,选择合适的测序平台,提高测序的深度和检测的灵敏度,显得尤为关键。目前,依据不同的原理,高通量测序常用的测序核酸包括以下几种:1)总RNA或总DNA (total RNA or DNA)；2)双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)；3)病毒粒子相关核酸(virion-associated nucleic acids，VANA)；4)sRNA (small RNA)。

3.1 总RNA或总DNA

研究感病植物中病毒种类的最直接的方法就是测序总核酸,提取总RNA或者总DNA,进行高通量测序,理论上可以检测到所有RNA或者DNA病毒,对病毒的群体进行研究。Rwahnih 和Adams等[20-21]最早于2009年通过提取总RNA进行高通量测序的方法,成功从葡萄和观赏植物蛇鞭菊中检测到新的病毒。以总RNA和总DNA为测序靶标,已发现了约34种新病毒[26]。然而,这种方法最大的弊端是测序测得的90%以上序列来自于寄主基因组,而非病毒基因组,在这种复杂序列背景下,含量低的植物病毒会检测不到。

3.2 双链RNA

多数RNA病毒在复制过程或基因组组装过程中会产生双链形态的RNA(double stranded RNA,dsRNA), 这是病毒所特有的形态,因此以dsRNA为测序模板,能够更高效地获得病毒特异性序列,在无寄主基因组序列干扰的情况下,提高了测序深度,降低了测序成本[33-34]。Rwahnih在鉴定葡萄西拉病毒1(GrapevineSyrahvirus-1)时,分别测序了总RNA和dsRNA,结果发现dsRNA作为测序模板会获得更多病毒来源的reads,灵敏度更高。并且,以dsRNA为测序模板能够有效地检测真菌病毒及双链RNA病毒,Roossinck等在这个研究领域取得了很多成果。2010年,Roossinck建立了以dsRNA为测序模板,通过高通量测序研究病毒群体的测序流程[33],为了能在数据量有限的前提下,最大可能地测得病毒来源的序列,他们将来源不同的植物样品混合成一个测序样品 (pooled samples)进行测序,每个植物样品在cDNA制备过程中都带有4碱基的序列标签,使得测得的序列结果可以追溯到相对应的寄主植物,在显著降低测序成本的同时,可以对病毒种群多样性及生态学进行研究,意义重大[26]。然而,这种测序方法的缺点是不能有效地检测负义单链RNA病毒和DNA病毒,而且双链RNA的制备目前多采用CF-11特异性结合dsRNA的方法提取[35],耗时长,操作复杂。

3.3 病毒粒子相关核酸

最初,通过提取病毒的粒子,从中提取病毒相关的核酸进行测序,这种策略被用于检测动物和人体组织中的RNA和DNA病毒[36-38]。直到2006年,Zhang等[39]在对人类粪便的病毒种群研究中发现:粪便样品中绝大多数RNA病毒序列与多种植物RNA病毒相似,其中数量最多的是辣椒轻斑驳病毒(Peppermildmottlevirus, PMMoV),令人震惊的是,从人类粪便中分离出来的类PMMoV 病毒片段能够感染健康的辣椒植株,从中能够重新检测到 PMMoV,这是利用VANA检测植物病毒的首个实例[39]。常规的步骤包括以下几步:通过超速离心或过滤的方法分离病毒粒子,然后利用 RNA酶和DNA酶降解无包裹的核酸,超速离心获得纯化的病毒粒子,最后提取病毒粒子内的核酸分子[26]。制备好VANA后,结合RT-PCR和klenow长片段扩增,可以同时检测RNA病毒和DNA病毒[31]。采用这种方法,现已检测并鉴定了近10种新病毒[26],其中包括双生病毒科的两种新病毒Euphorbiacaput-medusaelatentvirus和Sugarcanewhitestreakvirus,分别属于Capulavirus属和玉米线条病毒属 (Mastrevirus)。通过纯化VANA检测病毒的优势在于,它能够去除寄主基因组序列,消除无关序列干扰,达到最大化地富集病毒序列的目的。可能的缺点是无法检测无蛋白外壳或无稳定外壳包裹的病毒和类病毒,并且样品制备过程冗长、复杂。

3.4 Small RNA

当病毒侵入寄主细胞后,植物会启动RNA沉默机制来抵抗病毒的侵入和危害,这是一种广泛存在于植物体的抗病毒机制。病毒在复制、转录过程中会产生双链形态的RNA,被寄主的核酸内切酶(dicer-like protein)切割成小干扰RNA分子(small interfering RNAs, siRNAs),借助于RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC),siRNA会序列特异性地结合并降解病毒基因组RNA或mRNA,从而达到清除病毒的目的。Kreuze等[22]最早利用siRNA进行NGS测序,通过序列组装,从感病样品中同时检测到了ssRNA病毒、ssDNA病毒和dsDNA病毒等不同基因组类型的病毒。迄今,应用该方法已经成功发现30多种新病毒[26],其中双生病毒有11种,分别来自于甘薯、柑橘、葡萄、苹果、桑树等作物[32, 40-46]。由此可见,测序siRNA来检测双生病毒是十分有效的。

4 双生病毒

双生病毒是一类对多种作物造成毁灭性危害的DNA病毒[47],其寄主范围十分广泛。过去20年里,双生病毒已对番茄、棉花、辣椒、木薯、玉米、小麦、朱槿、哈密瓜等多种主要农作物造成了严重的危害,给农业生产造成很大损失[47-52]。

双生病毒科(Geminiviridae)病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状 DNA 病毒。其粒子呈双联体形态,大小约 22 nm×38 nm,无包膜。根据寄主范围、传毒介体、基因组结构和序列相似性的不同[53],国际病毒分类委员会在2014年建议将双生病毒科划分为7个属,包括原有的4个属:玉米线条病毒属(Mastrevirus)、菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)和新增的3个属:伊朗甜菜曲顶病毒属(Becurtovirus)、画眉草条纹病毒属(Eragrovirus)和芜菁曲顶病毒属(Turncurtovirus)[54]。2013年,Bernardo等[42]从大戟科孔雀球中分离到一个新的双生病毒,其基因组结构与已知双生病毒有较大差异,因此作者建议成立一个新的属:Capulavirus。同样的,Poojari等[43]从葡萄中也分离到一个与已知双生病毒差异较大的新病毒,他建议成立一个名为Graingemvirus的新属。已划分的7个属中,除菜豆金色花叶病毒属的病毒含有单组分或双组分基因组外,其余6个属的病毒都含有单组分基因组。部分单组分的菜豆金色花叶病毒属病毒伴随有卫星 DNA分子。

4.1 木本植物中的双生病毒

目前,已分类的双生病毒有371种,其中的大多数病毒是从草本植物中分离出来的,这种现象似乎暗示了双生病毒只能侵染草本植物。然而近年来,应用传统检测方法或高通量测序技术,多种木本植物上的新双生病毒被鉴定和报道[41-42, 45, 55-58]。例如,采用滚环扩增法(rolling circle amplification, RCA),Polston等[55]从佛罗里达州的麻风树属珊瑚花中分离到了新的双生病毒麻风树花叶病毒(Jatrophamosaicvirus, JaMV);2015年,Basso等[56]同样利用滚环扩增的方法从巴西的苹果、梨和葡萄中分离出同一种新的双生病毒——温带水果腐烂相关病毒(temperate fruit decay-associated virus, TFDaV)。然而,借助于高通量测序技术,通过测序sRNA、DNA或dsRNA,研究人员相继从柑橘[41]、葡萄[40, 57]、苹果[45]、桑树[58]等多种木本植物中分离到基因组结构独特的新的双生病毒,且多与类病毒发生混合侵染(表2)。由此可见,双生病毒不仅在经济作物、草本植物上有发生,在观赏植物、木本植物上也有发生,高通量技术在新的双生病毒,尤其是木本植物上的双生病毒的鉴定上十分占优势。同时,双生病毒寄主范围之广泛应当引起全世界的高度重视,也促使人们积极开展抗双生病毒的研究,寻找防治该病毒的新策略。

表2 应用高通量测序技术从木本植物中检测到的双生病毒1)

1) CCDaV:Citruschloroticdwarf-associatedvirus; GRBaV:Grapevineredblotch-associatedvirus; AGV:Applegeminivirus; MMDaV:Mulberrymosaicdwarf-associatedvirus; CEVd:Citrusexocortisviroid; CDVd:Citrusdwarfingvirus; HpSVd:Hopstuntviroid; GLRaV:Grapevineleafroll-associatedvirus; GRSPaV:Grapevinerupestrisstempitting-associatedvirus; ASSVd:Applescarskinviroid; GLVd:Grapevinelatentviroid; MscVd: Mulberry small circular viroid-like RNA.

4.1.1 柑橘褪绿矮缩相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus, CCDaV)

柑橘褪绿矮缩病(Citrus chlorotic dwarf disease, CCDD)是一种嫁接传染病, 1980年于土耳其首次报道,该病害会导致叶片卷曲、皱缩、反卷和畸形,有的叶片会表现褪绿斑驳,幼苗感染该病毒会表现丛生和矮化症状,严重影响柑橘的产量和品质[32]。因此,在土耳其,柑橘褪绿矮缩病被认为是柑橘上最严重的病害[59-61],因其病原未知,该病害一直没能得到有针对性的防治。

近年来,Loconsole等利用高通量测序技术,对该病害的病原进行了研究。通过测序其siRNA和DNA,从中鉴定出一种新的双生病毒,该病毒可通过嫁接传染,与病害的发生具有相关性,故将其命名为柑橘褪绿矮缩相关病毒(Citrus chlorotic dwarf associated virus, CCDaV)。柑橘褪绿矮缩相关病毒CCDaV的基因组为单链环状DNA,全长3 640 nt,基因组结构与其他双生病毒相似,含有双生病毒保守的一个基因间隔区(intergenic region),包括双生病毒复制和转录所必需的结构域以及茎环结构,环中具有 9 碱基保守序列“TAATATTAC”; 预测含有5个开放阅读框(open reading frame, ORF),病毒链含有3个阅读框(V1, V2, V3),分别编码病毒外壳蛋白(coat protein, CP)和运动相关蛋白(movement protein, MP),互补链含有两个阅读框(C1, C2),编码与病毒复制相关的蛋白(replication-associated protein, Rep)。

不同于其他的双生病毒:1)柑橘褪绿矮缩相关病毒的基因组(3 640 nt)是目前已知最长的;2)其病毒链含有3个开放阅读框, V3可能编码与细胞间运动相关的蛋白(MP),这与甜菜曲顶病毒属病毒的结构类似,但两者的V3阅读框的位置不同;3)另外,其互补链存在一个内含子区(图2),长度为113 nt,转录时可能会发生内含子的剪切从而表达融合蛋白Rep[58],然而这种剪切策略通常发生在玉米线条病毒属(Mastrevirus)病毒的表达过程[62]。鉴于柑橘褪绿矮缩相关病毒的基因组结构的特殊性,Loconsole提议将其列为双生病毒科新属的成员[41]。

2015年,在我国云南省,首次从感病的‘尤力克’柠檬(‘Eureka’ lemon)中检测到柑橘褪绿矮缩相关病毒,研究发现该病毒可通过嫁接方式传染大红橘(C.tangerinaHort.exTanaka)和柚子不同品种。其中，酸柠檬(C.aurantifolia)、塔希提酸橙(C.×latifolia)和‘水晶’蜜柚及‘洪玉仙’蜜柚等感染该病毒后表现明显的病害症状,‘琯溪’蜜柚无明显症状表现[63]。在调查病害发生情况的同时,研究人员收集感病‘尤力克’柠檬树上的成年柑橘粉虱[Dialeurodescitri(Ashmead)],通过PCR试验从柑橘粉虱体内中检测到了CCDaV,并且柑橘粉虱发生量大的果园该病害也越严重,由此推测,柑橘粉虱可能是该病毒的传毒介体之一[63]。

4.1.2 葡萄红斑相关病毒(Grapevine red blotch-associated virus, GRBaV)

葡萄红斑病最早发现于加利福尼亚的纳帕山谷(Napa Valley)[64],感病葡萄叶片的边缘和叶脉变红,叶片出现红斑,感病果实中糖分含量降低,严重影响果实品质[57]。因此,2008年,科学家开始对红斑病进行研究,探究其病原。2013年, Al Rwahnih等人通过宏基因组测序技术,结合滚环扩增技术RCA和传统PCR技术,从感病葡萄品种‘Cabernet Franc’,‘Cabernet Sauvignon’和‘Zinfandel’中分离到了一种新的双生病毒,该病毒基因组为单链环状DNA分子,单组分,全长3 206 nt,含有6个开放阅读框,正义链含有3个阅读框(V1～V3), 互补链含有3个阅读框(C1～C3),在互补链存在一个内含子,阅读框C1和C2表达融合蛋白-复制相关蛋白Rep。并且该病毒可通过嫁接传染,与病害症状的发生相关,因此将其命名为葡萄红斑相关病毒(Grapevine red blotch-associated virus, GRBaV)。

与此同时,美国的研究者Krenz等人在纽约州也发现了这种新病毒,将其命名为Grapevine cabernet franc virus (GCFV)[40];同样的,2013年,Poojari等人报道了华盛顿地区葡萄红叶相关病毒(Grapevine redleaf associated virus，GRLaV)的发生。然而以上3个不同名字的病毒,虽然分离自美国不同的地区,但却是同一种病毒,最终定名为葡萄红斑相关病毒GRBaV。Poojari的介体传播试验证明:在温室培养条件下,该病毒能够通过弗吉尼亚五叶地锦叶蝉(ErythroneuraziczacWalsh)在葡萄植株间传播[43]。2014年,Krenz等[44]建立了GRBaV的多重PCR检测技术,2015年的病害调查数据显示,该病毒广泛发生于加利福尼亚州、华盛顿、俄勒冈州、佐治亚州、马里兰州、新泽西州等北美大部分州,且该病害的全面大暴发已经对葡萄产业造成了巨大损失[65]。

4.1.3 苹果双生病毒(Apple geminivirus, AGV)

苹果是我国栽培面积最大、总产量最高的水果(FAO, 2012),然而近年来,病毒病及类病毒病的发生严重影响苹果产业的健康发展。

本实验室利用高通量测序技术对苹果样品中的siRNA进行测序,从中鉴定出一种新病毒,含有双生病毒的保守结构特征,因此将其命名为苹果双生病毒(Apple geminivirus,AGV)[45]。苹果双生病毒基因组为单链环状DNA分子,单组分,全长2 932 nt,含有6个开放阅读框,正义链含有两个开放阅读框(V1, V2),互补链含有4个开放阅读框(C1-C4),序列比对及结构域预测显示,C1和C2编码与复制相关的蛋白Rep,V1可能编码外壳蛋白CP,而V2编码的蛋白质功能尚未知。基于复制相关蛋白Rep构建的系统发育树显示,苹果双生病毒可能是菜豆金色花叶病毒属的成员,然而基于外壳蛋白CP的系统发育分析显示该病毒可能是尚未知的新属的成员[45]。

对山东、陕西、江苏和辽宁的部分苹果样品进行该病毒的检测发现,该病毒能够侵染‘富士’、‘嘎啦’和‘粉果子’等常见品种,但侵染率较低,仅为7.2%(12/165),常不表现症状[45]。利用苹果双生病毒的侵染性克隆进行生物学测定,显示该病毒能够侵染本氏烟、心叶烟和番茄,但也无明显症状,据此推测该病毒可能尚不具有强致病性,至于是否侵染其他寄主,是否造成严重症状,以及传毒的介体是什么等问题还需进一步研究。

4.1.4 桑花叶萎缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf associated virus, MMDaV)

桑花叶型萎缩病(mulberry mosaic dwarf disease, MMDD)是一种困扰桑树生产长达数十年的重要病害, 感病桑树植株矮小,叶片卷曲、花叶,严重影响桑蚕产业的健康发展[66-67]。因病原未明确,该病多年来一直没能得到有效的防治。借助于高通量测序技术,该病害的研究取得了重大进展。本实验室从感病样品中检测到一种新的双生病毒,该双生病毒的侵染率高达92%,健康样品侵染率为0,MMDaV与MMDD的发生具有极大的相关关系,因此将其命名为桑花叶萎缩相关病毒(Mulberry mosaic dwarf associated virus, MMDaV)[58]。

MMDaV的基因组为单组分、单链环状 DNA, 全长2 952 nt。除了具有双生病毒科病毒保守的结构之外,该病毒开放阅读框的个数及位置不同于其他双生病毒,病毒链含有5 个阅读框(V1～V5),互补链含有 2 个阅读框(C1～C2)。V1 可能编码病毒的外壳蛋白CP; V3 编码的蛋白含有一个跨膜结构域,推测与跨膜运输有关,行使运动蛋白的功能; C1 和 C2 编码与复制相关的蛋白。与柑橘双生病毒CCDaV类似,MMDaV的互补链相似位置也存在一个内含子区(图1),长度为101 nt,RT-PCR试验验证了其体内剪切活性。与此同时,高通量测序数据中有136条reads是横跨内含子区域的,覆盖剪切后的转录本(图1),这分别是内含子剪切的直接和间接证据。同时,对近期鉴定的一些双生病毒进行内含子的预测及分析,发现除了CCDaV和MMDaV外,在GRBaV和EcmLV的相似位置也存在内含子,根据剪接方式和结构判断,这些内含子都属于U2 型的真核 mRNA 内含子。剪接位点序列的高度一致且不同于其他双生病毒,这一特性暗示MMDaV和CCDaV可能具有相似的特性和较近的亲缘关系。然而,更加有力和直接的证据来自系统发育分析,结果显示:MMDaV和CCDaV共同存在于一个单独的分支,且未归属到任何已知的属中, 因此,我们建议将这两种病毒共同归于一个新属。

图1 MMDaV和CCDaV互补链的内含子序列Fig.1 Sequences of introns identified in the complementary sense transcripts of MMDaV and CCDaV

4.2 双生病毒防治的新策略

目前,双生病毒的防控策略主要包括:选育抗病品种,控制传毒介体,利用植物的基因沉默机制等[68-73],然而,所有这些策略的功效甚微。近日,一些研究显示CRISPR-Cas系统能够[74-75]特异识别病毒和外源DNA,将该系统引入植物,在植物中建立一套DNA病毒防御体系。以甜菜严重曲顶病毒(Beet severe curly top virus, BSCTV)为模式病毒,分别选取模式植物本氏烟(Nicotianabenthamiana)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)为寄主材料,利用本氏烟注射表达系统,建立了高效的抗病毒sgRNA活性筛选体系,并在瞬时转染植物及转基因植物中同时证明:CRISPR/Cas系统能够有效地抑制BSCTV在寄主植物中的积累[75]。2015年Ali等[74]利用sgRNA 靶向番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)的编码区和非编码区,结果显示sgRNA 靶向病毒基因间隔区(intergenic region，IR)能够有效地降低病毒的含量并减弱病害症状,对病毒侵染抑制效果比靶向 CP 或者 Rep 编码区的抑制效果更强。靶向IR区的SgRNA-Cas9系统也成功用于抑制其他两种双生病毒-甜菜曲顶病毒(Beetcurlytopvirus，BCTV)和鱼黄草花叶病毒(Merremiamosaicvirus，MeMV)。

中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组的研究发现:在 sgRNA 的引导下,Cas9 能够引起植物病毒多个关键功能区(如 IR 区)核苷酸序列的删减或突变,研究还发现高效靶位点的选取与靶位点序列所在基因的功能无直接关系[76]。利用此方法培育抗病毒植物,不必基于病毒基因功能的深入了解,简单易行,通用性强,因此,该研究对培育抗DNA病毒作物具有指导意义。

5 结语

高通量测序技术的诞生,为植物病毒的检测带来了新的方法和解决方案,极大地推进了植物病毒研究的进程。然而,高通量测序技术并非完美,存在着一系列待解决的问题。例如:NGS 在为我们提供海量数据的同时,其错误率也是比较高的(0.1%～15%),其测序质量有待提高;读长相对于传统的桑格测序也较短,虽然第三代测序技术单分子实时测序法(single-molecule real-time sequencing, SMRT)能够很好地解决读长短的问题,然而其昂贵的费用及通量的限制成为其进一步广泛推广的障碍。

高通量测序技术在植物病毒诊断领域的应用,使得我们能够更容易地鉴定更多数量的新病毒和新的类病毒。然而,这个过程却需要更加严格的实验操作和严谨的科研态度。例如:高通量测序的高灵敏度使得测序过程中的污染问题十分普遍和棘手,这种错误或者污染常发生在样品处理和制备过程中、上机测序甚至数据分析过程中,这将造成结果的不可信,处理起来极为麻烦。为了解决这个问题,除了操作过程更加严格外,Galan等[77]巧妙地在样品提取过程中、cDNA制备过程中及测序过程中等都分别加入了空白对照,来排除各种可能存在的污染,设置相应的阈值对所有数据进行处理和筛选,去除不准确及错误的数据,得到更为准确的结果。虽然这项研究是应用在16S rRNA的高通量测序中,但对于植物病毒的检测,尤其是大样本中病毒种群的研究来说具有很好的借鉴意义。再比如,借助于高通量的测序技术,我们可以一步到位地得到病毒的遗传信息,却往往忽略了传播方式和寄主范围等重要的生物学信息,而这些信息在鉴定病害的病原及对新病毒进行分类时,都是不可或缺的。同时,传统试验技术手段的实施及柯赫氏法则的验证都有利于佐证高通量测序的结果,使我们得到更准确的结论。但是,目前缺少快速灵敏有效的生物学测定方法,用于高通量方法发现的新病毒或者类病毒的验证,这方面是摆在研究人员面前的一个难题。

在对植物病毒,尤其是双生病毒的种类进行统计时发现,大多数的病毒分离于草本植物,而从木本植物中分离的相对较少,分析可能的原因有以下几点:1)木本植物中病毒的含量较低、不同组织间病毒分布不均;2)坚硬的叶片及植物组织中多糖和单宁含量较高对核酸的提取造成很大困难;3)发现新病毒后的生物学测定及科赫氏法则验证都需要更长的试验周期,难度也远远高于草本植物；4)从事木本植物病毒研究的人员和经费相对较少。这种草本植物和木本植物间的偏向性同样发生在主要农作物与野生植物之间,这种偏向性不利于了解病毒在自然状态下的真实发生情况,更加不利于病毒种群多样性的研究,甚至可能错失优良的抗病毒植物资源。因此,未来对木本植物和野生植物上病毒的研究值得我们更多的关注。

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(责任编辑：田 喆)

Application of next-generation sequencing technology in identification of geminiviruses from woody plants

Ma Yuxin, Li Shifang

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Next-generation sequencing (NGS) platforms provide highly efficient, rapid, low-cost high-throughput DNA sequencing. Since 2009, NGS has been applied to plant virology, including discovery of novel viruses, identification of pathogens and analysis of genome diversity and evolution, which speeds up the process of plant virology research. Over one hundred novel plant viruses and/or viroids have been successfully identified by NGS so far. Geminiviruses (FamilyGeminiviridae) with circular, single-stranded DNA genome have caused devastating effect on many crops. To our knowledge, most of them generally infect herbaceous plants. However, many new geminiviruses, recently identified by NGS, were detected from perennial woody plants like citrus, grapevine, apple and mulberry. These studies have shown the superiority of NGS technology over conventional detection protocols. This paper reviews the application of NGS in plant virology and mainly demonstrates its application in detection of geminiviruses from perennial woody fruit trees.

next-generation sequencing; geminiviruses; diagnosis of plant virus; perennial woody plant

Invited Paper

2016-10-08

2016-10-09

公益性行业(农业)科研专项(201203076)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.001

* 通信作者 E-mail:sfli@ippcaas.cn