， ， ， ， ， (1.贵州省生物技术研究所, 贵阳 550006； 2.贵州省农业生物技术重点实验室, 贵阳 550006；.六盘水师范学院生命科学系, 贵州 水城 55006； .贵州省现代中药材研究所, 贵阳 550006；5.贵州省农业科学院, 贵阳 550006)

西南地区市场冰球子分子鉴定

朱英1,2，杨友联3，黄永会1,2，刘永翔1,2，张丽娜4，刘作易2,5
(1.贵州省生物技术研究所, 贵阳 550006； 2.贵州省农业生物技术重点实验室, 贵阳 550006；3.六盘水师范学院生命科学系, 贵州 水城 553006； 4.贵州省现代中药材研究所, 贵阳 550006；5.贵州省农业科学院, 贵阳 550006)

利用rDNA ITS和叶绿体trnL-F序列，对17份西南地区冰球子进行分子鉴定。采用改进CTAB法提取独蒜兰叶片基因组DNA，利用通用引物ITS 1和ITS 4以及引物trnL-F对其DNA中rDNA ITS区和叶绿体trnL-F序列进行扩增，对目的片段进行测序并对测序结果进行聚类分析。结果表明，17份西南独蒜兰代表3个种，即云南独蒜兰、独蒜兰和一未定种，药源基本可靠。

rDNA ITS序列；trnL-F序列； 独蒜兰属； 兰科植物

独蒜兰属(Pleione)为兰科植物中具观赏价值和药用价值的一个属，全属约20个种，我国有16个种。独蒜兰属一般为陆生、岩生或附生，主要分布于我国长江流域及以南的广大地区。民间以假鳞茎入药，有清热解毒、消肿散结、化痰止咳之功效，用以治疮疖痈肿、毒蛇咬伤。2010版《中华人民共和国药典》中将独蒜兰与云南独蒜兰合称冰球子列入山慈菇药材项下。西南地区药材市场常有冰球子鲜品出售，但由于仅有药用部分假鳞茎而无花等重要形态鉴定依据，极难准确判定药源的可靠性。

独蒜兰资源种类较多，单纯依靠传统的形态学方法难以做出精确鉴别。由于ITS序列进化极快，近年来已广泛用于中药材以及兰科的遗传多样性和系统发育关系分析[1-2]。而由于植物线粒体基因进化速率较慢、遗传分化小，而核基因又存在多拷贝、种内变异大、引物通用性差的特性，因此植物学家们最终选定叶绿体基因展开了有关植物DNA条形码的研究，但目前尚未找到理想的植物DNA条形码。叶绿体基因组DNA中trnL-F基因内的非编码区，其进化速度较快，高度保守，对高度降解的DNA样本仍可以进行有效扩增[3]。本研究采用ITS和trnL-F序列产物直接测序的方法，对17份西南地区市场出售的冰球子进行分析，以考证药源的基本情况，并为独蒜兰属植物系统发育研究、分类鉴定提供理论依据。

表1 供试的17份独蒜兰材料

编号材料名称采集地编号材料名称采集地编号材料名称采集地1云南云南8凉山6四川18楚雄1云南2凉山1四川9丽江1云南19楚雄2云南3凉山2四川10丽江2云南20其它1云南或四川5凉山3四川11丽江3云南21其它2云南或四川6凉山4四川13雷山1贵州22其它3云南或四川7凉山5四川17雷山2贵州

表2 用于系统发育分析的独蒜兰属植物及相近属植物的rDNA ITS区序列

种名 登录号 种名 登录号 种名 登录号P．saxicolaC369AF461492．1P．pleionoidesC308AF461480．1P．formosanaC320AF461485．1P．hookerianaC322AF461468．1P．formosanaC319AF461486．1P．formosanaPF⁃10EU100755．1P．grandifloraC327AF461475．1P．formosanaPF⁃2EU100747．1P．formosanaPF⁃9EU100754．1P．grandifloraC325AF461473．1P．formosanaPF⁃13EU100758．1P．scopulorumC408AF461471．1P．chuniiC311AF461467．1P．formosanaPF⁃11EU100756．1P．humilisC409AF461495．1P．grandifloraC307AF461477．1P．formosanaPF⁃3EU100748．1P．coronariaC407AF461470．1P．forrestiiC321AF461478．1P．formosanaPF⁃15EU100760．1P．yunnanensisC310AF461487．1P．limprichtiiC317AF461489．1P．formosanaPF⁃1EU100746．1P．praecoxC368AF461491．1P．bulbocodioidesC313AF461482．1P．formosanaPF⁃14EU100759．1P．formosanaAF302740．1P．pleionoidesC309AF461481．1P．formosanaPF⁃8EU100753．1P．bulbocodioidesAF302739．1P．bulbocodioidesC312AF461483．1

1 材料与方法

1.1 供试材料

用于实验的17份独蒜兰材料由贵州省现代中药材研究所提供(表1)，该所从各地区药材市场采购假鳞茎鲜品后种植于贵州省农业科学院中药材试验地。

1.2 DNA提取

取独蒜兰的幼嫩叶片，参照陶刚等[4]的方法提取DNA。用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测总DNA质量及完整性。

1.3 rDNA ITS序列扩增及纯化测序

ITS片段扩增采用通用引物ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS 4(5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′)，trnL-F序列扩增引物(5′-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3′)和(5′-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′)，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。扩增反应体系为25μL，各种成分终浓度为Beffer(1×)、MgCl2(2.5 mmol/L)、dNTP Mix(0.5 mmol/L each)、Taqese(1 U)、Primer(0.25 mmol/L each)、DNA(2.0 ng/μL)。PCR反应体系在ABI公司9700型PCR仪上进行，ITS-PCR按照如下流程进行扩增反应：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性60 s，60 ℃复性40 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，8 ℃保温。trnL-F-P C R扩增程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 S；54 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 S；30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经纯化试剂盒(俄罗斯Biomed公司)纯化后直接用于测序(测序反应由上海英骏生物技术有限公司完成，测序仪器为ABI 3730 DNA测序仪)。

1.4 序列分析

将得到的供试独蒜兰材料ITS和trnL-F序列以及来自GenBank与之近似的序列(表2、表3)一起用于分子系统发育分析。通过Clustal-X 1.81[5]软件包对近似序列进行比对，再运用BioEdit version 5.0.9对比对结果进行手工校正，把上述处理的序列数据通过PAUP*4.0 beta 10[6]软件包，使用最大简约法分析(Maximum Parsimony Analysis,MP)构建系统发育树(MP tree)，通过1 000步重复获得的自展检验 (Bootstrap) 数值标记在分支上。

表3 用于系统发育分析的独蒜兰属植物及相近属植物的叶绿体trnL-F碱基序列

种名 登录号 种名 登录号 种名 登录号P．yunnanensisC3(22)AF503725．1P．pleionoidesC3(21)AF503720．1P．hookerianaC32(26)AF503714．1P．bulbocodioides(19)AF503707．1P．formosanaC314(24)AF503711．1P．grandifloraC3(27)AF503713．1P．limprichtiiC3(18)AF503717．1P．chuniiiC311(23)AF503726．1P．praecoxSBB04(28)AF503719．1P．pleionoidesC3(20)AF503721．1P．hookerianaC40(25)AF503715．1

2 结果与分析

在根据ITS序列构建的独蒜兰属系统树中，材料13与云南独蒜兰(Pleioneyunnanensis)聚为一进化支，支持率为87%；材料1、材料2等16份材料与独蒜兰(P.bulbocodioides)、四川独蒜兰(P.limprichtii)和美丽独蒜兰(P.pleionoides)亲缘关系较近，构成一进化支，但支持率低于50%，其中，材料2等13份材料在该进化支中聚为一亚进化支，支持率为53%(图1)。

图1 根据ITS 1-5.8S-ITS 2序列构建的MP树，显示独蒜兰材料与相近种参考序列的系统发育关系。分支显示大于50%的Bootstrap值。

在据于叶绿体trnL-F序列构建在系统树中，材料13与ITS构建的系统树一样，与云南独蒜兰(Pleioneyunnanensis)聚为一进化支，支持率亦为87%；材料17独立构成一进化支；材料2等15个材料与独蒜兰聚为一进化支，支持率为86%，在该进化支中材料2等13份材料聚为一亚进化支，支持率为60%。

结合ITS、trnL-F构建的系统树，可确定13号(雷山1号)材料为云南独蒜兰，17号(雷山2号)目前暂不能定种，其余15份材料为独蒜兰。

图2 根据叶绿体trnL-F碱基序列构建的MP树，显示独蒜兰材料与相近种参考序列的系统发育关系。分支显示大于50%的Bootstrap值。

3 结论与讨论

由于独蒜兰属种质资源较为丰富、起源驯化途径多样、栽培历史悠久、各地引种现象普遍，导致品种资源类型多且名称较乱，供试的17份独蒜兰种质收集于西南地区，对其真正的亲缘关系不完全清楚。而在亲缘关系鉴定上，由于受环境和栽培措施以及各生长发育阶段等条件的影响，通过植物学、农艺性状或同工酶等手段不易达到鉴别的目的，在评价时具有一定的局限性。分子标记方法为生物资源鉴定评价提供了新的途径。从ITS和叶绿体trnL-F序列构建的系统树来看(图1、图2)，叶绿体trnL-F序列优于ITS序列，分辨率更高。在ITS序列构建的系统树中，参与分析的该属多数近缘种不能有效区分。

西南地区药材市场销售冰球子药源总体趋势较好，除购自雷山的17号材料为非药典收录的外，其余16份均为独蒜兰或云南独蒜兰，其中主要为独蒜兰。17号材料目前不能有效定种，一方面是因为目前对独蒜兰属分子鉴定研究较少，可比对的序列有限，其二是形态上往往难以区分，故建议加强对该属的形态及分子系统学研究。对购自雷山的“冰球子”需引起重视，就目前不知其具体种名，对其药理及毒性等无法确切考证，势必造成潜在的危险。

[1]汪小全,洪德元.植物分子系统学近五年的研究进展概况[J].植物分类学报,1997,35(5):465-480.

[2]ZHANG Ming-Yong,SUN Cai-Yun,HAO Gang,et al.A Preliminary Analysis of Phylogenetic Relationships in Cymbidium (Orchidaceae)Based on nrITS Sequence Data[J].Acta Botanica Sinica,2002,44(5):588-592.

[3]Taberlet P,Gielly L,Pautou G,et al.Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J].Plant Molecular Biology,1991(17):1 105-1 109.

[4]陶刚,朱英,刘作易,等.野生黄花白芨的组织快繁及分子鉴定[J].种子,2008,27(8):22-24.

[5]Thompson J D,Gibson T J,Plewniak F,et al.The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic acids research,1997,25(24):4 876-4 882.

[6]Swofford D.L.“PAUP*.Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods).Version 4.”Sinauer Associates, Sunderland,Massachusetts,2003.

Molecular Identification of Bingqiuzi from Market in Southwest China

ZHUYing1,2,YANGYoulian3,HUANGYonghui1,2,LIUYongxiang1,2,ZHANGLi’na4,LIUZuoyi2,5
(1.Guizhou.Institute of Biotechnology,Guiyang 550006，China；2.The Key Laboratory for Agri. Biotechnology of Guizhou,Guiyang 550006，China；3.Department of Life Science，Liupanshui Normal College，Shuicheng 553006，China；4.Guizhou Institute of Modern Chinese Medicinal Materials,Guiyang 550006，China；5.Guizhou Academy of Agri.Sci,Guiyang 550006,China)

The rDNA ITS and chloroplasttrnL-F sequences were applied to molecularly identify 17 pleione in southwest China.The genomic DNA of pleione was extract from leaves with the improved CTAB method.Then,the rDNA ITS and chloroplasttrnL-F in the DNA were amplified with universal primers ITS 1 and ITS 4 and primertrnL-F separately.The expected fragments were sent to sequece and the results for cluster analysis showed that 17 pleione represent three species,Pleioneyunnanensis,P.bulbocodioidesand an unknown species,suggesting that the medicinal resouces of Bingqiuzi in Southwest China was basicly reliable.

rDNA ITS sequences;trnL-F sequences;Pleione; orchid.

2016-05-20

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(编号：黔科合社字[2009]5036号)；贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(编号：黔科合中药字[2011]5039号)；贵州省科研机构创新能力建设专项(编号：黔科合院所创能[2010]4002)；贵州省农业科学院资助项目(编号：黔农科合(创新基金)2012001号)；贵州省农业科学院基金项目(编号：黔农科合(基金)2011021)。

朱 英(1977—)，女，副研究员，主要从事贵州优质作物种质资源及重要功能基因的研究；E-mail：hawk2309@163.com。

刘作易，教授，博士；E-mail：gzliuzuoyi@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.012

S 567

A

1001-4705(2016)09-0012-04