周振勇，李娜，李红波，闫向民，张金山，杜玮，张杨

(新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000)



新疆褐牛种群遗传多样性分析

周振勇，李娜，李红波，闫向民，张金山，杜玮，张杨

(新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000)

【目的】检测新疆褐牛的遗传多样性及其不同居群(杂交类型)的亲缘关系。【方法】采用8对微卫星分子标记对新疆褐牛的4个群体进行遗传多样性与遗传结构分析。【结果】在192个个体扩增得到72个等位基因,每个位点平均等位基因数(A)为9。4个新疆褐牛群体的平均预期杂合度(HE)为0.716 2,平均观察杂合度(HO)为0.695 4，群体处于遗传平衡状态。群体平均多态信息含量和平均杂合度较高，4个群体8个位点的平均多态信息含量分别为0.673 6、0.622 0、0.626 5和0.541 3。群体基因流BM2133位点最大(7.096 5)，BM1824位点最小(2.112 8)，各位点平均基因流为4.008 9，4个群体间存在一定的基因交流。4个群体间的遗传变异为5.87%，另外94.13%的遗传变异由个体间的差异产生。基因流不是主导新疆褐牛种群遗传结构的关键因素。聚类分析显示4个群体可按遗传距离分为两类。【结论】新疆褐牛4个群体的遗传多样性丰富，可作为育种材料培育牛的新品种与新疆褐牛新类型。

新疆褐牛；群体遗传变异；微卫星位点；多态信息含量；杂合度；等位基因数；遗传结构

0 引 言

【研究意义】新疆褐牛是新疆牛品种的主导品种之一，主要分布在伊犁河谷和塔额盆地[1]，形成了育成地为中心(核心)向周边辐射的品种资源分布结构。近年来，新疆褐牛作为杂交改良父本在农牧区大面积推广，各地区新疆褐牛选育方向和选育进展各不相同，形成了以草原区新疆褐牛兼用或肉乳兼用的利用模式，农区新疆褐牛乳用或肉用二元利用模式，整个新疆褐牛种群从育成期的兼用型向肉用、乳用两个方向选育，伴随群体数量的扩张，新疆褐牛种群遗传结构模糊不清。【前人研究进展】国内学者在新疆褐牛的肉质营养调控[2]、导入杂交改良效果[3]、放牧条件下体型结构与参数[4]、高档牛肉生产[5]、产肉性能评价[6]、分子标记辅助选择[7-9]等众多层面开展了多方位立体化研究，建立了新疆褐牛生产性能估测模型与优化方法[10]，在育种环节以传统常规育种为基础，应用B超技术丰富了经济性状与肉质性状的测定方法[11-13]，促进了牛选育技术手段与选育效率的提升。在育种工作中，微卫星 DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性，使其成为居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记[14]。国内外学者普遍采用采用微卫星DNA遗传标记技术分析不同品种群体结构差异与差距[15]，通过遗传多样性分析[16-19]，掌握品种间的亲缘关系，为亲子鉴定[20,21]、杂交利用与选育提供分子依据。【本研究切入点】关于新疆褐牛的遗传多样性研究文献较少。研究采用微卫星技术，检测不同区域新疆褐牛群体与个体遗传差异及整体遗传结构。【拟解决的关键问题】为新疆褐牛选育与新类型培育提供分子水平的重要依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

研究样本采集新疆地区4个新疆褐牛种群的不同类型褐牛抗凝血样品192份(其中包括尼勒克县新疆褐牛(种群Ⅰ)60头、新源县新疆褐牛(种群Ⅱ)60头、特克斯县新疆褐牛(种群Ⅲ)60头、昭苏县新疆褐牛(种群Ⅳ)12头)，保存于-20℃冰箱备用。

1.2 方 法

1.2.1 引物来源及微卫星位点选择

微卫星标记参考世界粮农组织(FAO)推荐的25对微卫星位点，从中筛选出8对扩增条带清晰和多样性丰富的引物，分别是IDVGA-2、TGLA-44、ETH10 、IDVGA-44、BM1824、TGLA126、BM2133和BM864等8个检测位点，列出引物信息。表1

表1 新疆褐牛各微卫星位点引物信息

1.2.2 PCR 扩增

实验采用的微卫星引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。微卫星PCR扩增反应体系与反应条件，PCR反应体系：模板1 μL、引物 f 0.5 μL、引物 R 0.5 μL、dNTP 10 mM 0.5μL、TaqBuffer 2.5μL、25 mM MgCl22.0 μL、Taq酶5 U/μL 0.2 μL、水17.8 μL、反应总体积为25 μL。反应条件：95℃预变性3 min，(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s)循环10次，(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)循环20次，72℃延伸6 min，4℃保存。

1.2.3 电泳检测

每个引物随机挑4个检测，1%琼脂糖凝胶、150V、100 mA 20 min电泳观察，银染, 凝胶成像仪检测并拍照, 用 Gel-pro 软件包分析每个扩增条带的分子量。

1.3 数据统计

根据条带的位置确定基因型, 使用Genemapper软件分析SSR数据，进行群体遗传分析, 计算等位基因数(N)、有效等位基因(Ne)、等位基因频率(Pi),观测杂合度(observed heterozygosity, Ho)和期望杂合度(expectedheterozygosity, He)。利用pic-calc计算程式软件计算微卫星位点多态信息含量(polymorphisminformation content, PIC)。利用 ARLEQUIN 3.1计算群体内近交系数(Fis)、群体遗传固定系数(Fst)及基因流(Nm)等。采用GENEPOP软件计算群体间 Nei’s遗传距离(Genetic distance, DA)，绘制UPGMA聚类图。

2 结果与分析

2．1 褐牛群体与不同区域性种群微卫星位点遗传特性

8个微卫星位点在群体中表现出的特性由表1所示。褐牛群体中TGLA126微卫星位点的多态信息含量为0.45属于中度多态(0.5>PIC>0.25)，IDVGA-2、TGLA44、ETH10、IDVGA-44、BM1824、BM2133、BM864等微卫星位点的多态信息含量分别为0.69、0.61、0.71、0.73、0.66、0.79、0.76均为高度多态(PIC>0.5)。表1，表2

表2 褐牛群体微卫星位点遗传特性分析(观测等位基因数与有效等位基因数)

2.2 微卫星等位基因与分布

等位基因组成是长期进化的产物，有效等位基因数是用于度量群体遗传多样性的指标。研究中，8个微卫星位点在192头褐牛中共检测到72个等位基因，平均每个基因座检测到9个等位基因，有效等位基因数在2.03～5.44，平均值为3.75，基因频率的差异，导致有效等位基因数目和实际检测到的等位基因数目有差异。各微卫星位点上的观测等位基因数与有效等位基因数在不同种群中均存在明显差异，表明各微卫星在群体内和群体间的分布都不均衡。表3

表3 4个褐牛群体观测等位基因数与有效等位基因数

2.3 群体内的遗传变异

群体内的遗传变异衡量群体内遗传变异的指标多用群体多态信息含量(PIC)和基因杂合度(H)来表示。PIC反映群体蕴藏遗传信息的多少，H反映基因纯合程度。当PIC≥0．5时为高度多态基因座；0．25≤PIC<0．5时为中度多态基因座；PIC<0．25时为低度多态基因座。H越高，群体的变异程度越大，育种中可供选择的余地就越大。

研究表明，新疆褐牛群体中，8个微卫星位点表现为高度多态性；种群Ⅱ与种群Ⅲ中， TGLA126位点表现为中度多态性，其他7个位点均表现为高度多态性：种群Ⅳ中，BM1824、TGLA126、BM864 位点均表现为中度多态性，其余5个位点表现为高度多态性。4个群体8个位点的平均多态信息含量分别为0.673 6、0.622 0、0.626 5和0.541 3。多态信息含量低的位点其观测杂合度也低，反之亦然。表明各位点观测杂合度的变化趋势与多态信息含量的变化基本一致，说明该试验结果可信。表4

杂合度反映群体在多个位点上的遗传变异，一般认为它是度量群体遗传变异的一个最适参数，分观察杂合度和期望杂合度，两者越接近，表明该品种受外来选择及近交等因素的影响较小，8个位点的观察杂合度在0.454 3～0.771 3，平均值为0.662 6。观察杂合度0.662 6与期望杂合度0.716 2接近，群体处于遗传平衡状态。表5

表4 4个群体8个微卫星位点的多态信息含量与杂合度

表5 8个微卫星位点纯合度与杂合性

2.4 群体间的遗传变异

衡量群体近交程度和群体间遗传分化程度的指标是F统计量，包括亚群体的固定指数(Fis)、总群体的固定指数(Fit)和亚群体间的基因分化率(Fst)。任何携带有遗传物质的个体在群体内和群体间的流动称为基因流(Nm)。

研究表明，各位点亚群体的固定指数(Fis)均小于总群体的固定指数 (Fit)，亚群体间的基因分化率(Fst)因微卫星位点不同而各有差异，其中BM1824位点最高(0.105 8)，TGLA44位点最低(0.028 1)；各微卫星位点的平均Fis为-0.009 2，平均Fit为0.050 1，平均基因分化率为0.058 7，表明各亚群体的稳定性不如总群体，四个群体间存在一定程度的分化。

群体基因流也因微卫星位点不同而不同，BM2133位点最大(7.096 5)，BM1824位点最小(2.112 8)，各位点平均基因流为4.008 9，表明4个群体间存在一定的基因交流。表6

表6 群体的F统计量和基因流值

Note:*Nm = Gene flow estimated from Fst = 0.25(1 - Fst)/Fst

2.5 褐牛群体间的遗传距离

研究采用奈氏标准遗传距离(Ds)和奈氏遗传距离(DA)两种方法分析群体间的遗传距离，遗传距离越小群体分化时间越短。结果表明：种群Ⅰ与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的奈氏标准遗传距离(Ds)分别为0.079 7、0.129 1、0.191 5，种群Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ的奈氏标准遗传距离(Ds)分别为0.186 8、0.118 1，种群Ⅲ与种群Ⅳ的奈氏标准遗传距离(Ds)为0.1461；4个种群间奈氏遗传距离(DA)与奈氏标准遗传距离(Ds)变化趋势一致。表7。

表7 个不同群体褐牛的奈氏遗传距离

注：左下为奈氏标准遗传距离(Ds)，右上为奈氏遗传距离(DA)

Note: In the lower left for Nei's standard genetic distances (Ds), on the right for the Nai's genetic distance (DA)

2.6 群体聚类分析

采用GENEPOP软件，根据分子标记资料计算4个褐牛群体在8个微卫星位点上的遗传距离，绘制UPGMA聚类图，结果显示尼勒克县新疆褐牛和新源县新疆褐牛首先聚在一起，特克斯县新疆褐牛和昭苏县新疆褐牛聚在一类。图1

图1 新疆褐牛4个群体间亲缘关系树状图

3 讨 论

3.1 褐牛群体内遗传变异

研究4个群体的观测等位基因数与有效等位基因数差异较大，各微卫星在群体内和群体间的分布都不均衡。相同等位基因在不同群体中的分布不均匀。多态信息含量和观测杂合度较高且数值相近表明该品种受外来选择及近交等因素的影响较小。结果显示4个褐牛群体与整个种群处于遗传平衡状态。

3.2 褐牛群体间遗传变异

褐牛群体间平均Fst为0.058 7，表明群体间的遗传变异为5.87%，另外94.13%的遗传变异由个体间的差异产生。群体间平均基因流为4.008 9，不同微卫星基因位点的基因流均大于1，群体间基因流大于l就能有效抑制由遗传漂变引起的遗传分化，4个亚群体间的稳定性没有整个群体的稳定性高。

4 结 论

当前新疆褐牛群体处于遗传平衡状态，群体稳定性较高，受外来品种影响较小。不同区域的褐牛群体在微卫星位点均具有多态性，遗传多样性丰富，为区域性褐牛类型的培育奠定了选育基础。同时，结合新疆褐牛育种工作实际，参照新疆褐牛种群间的遗传距离与基因差异，新疆褐牛可分为2个类群，一个是以尼勒克县新疆褐牛、新源县新疆褐牛为聚类的兼用型褐牛种群，另一类是以特克斯县新疆褐牛、昭苏县新疆褐牛为聚类的肉用种群。

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Fund project:Supported by Major projects of science and technology research program in Xinjiang Uygur Autonomous Region " Research and demonstration of new breed (line) cultivation and hybrid improvement technology of Xinjiang beef cattle" (201230116-10)

Population Genetic Diversity of Xinjiang Brown Cattle

ZHOU Zhen-yong, LI Na, LI Hong-bo, YAN Xiang-min, ZHANG Jin-shan,DU Wei, ZHANG Yang

(Research Institute of Animal Husbandry, Xinjiang Academy of Animal Sciences, Urumqi 830000, China)

【Objective】 To detect Xinjiang Brown Cattle Genetic diversity and different populations (hybrid type) of genetic relationship.【Method】Eight microsatellite markers were used to carry out genetic diversity and genetic structure analysis of the four natural populations of Xinjiang brown cattle.【Result】In 192 individuals amplified 72 alleles, the average number of alleles per locus (A) was 9.4, Xinjiang Brown Cattle natural populations average expected heterozygosity (HE) was 0.716,2, and the average observed heterozygosity (HO) was 0.695,4, populations in genetic equilibrium. Population was in a state of genetic equilibrium. The average polymorphism information content and average heterozygosity were higher. The average polymorphism information contents of 8 loci in 4 populations were 0.673,6, 0.622,0, 0.626,5 and 0.541,3, respectively. Population gene flow BM2133 locus was the maximum (7.096,5), and BM1824 locus was the minimum. The average gene flow between the groups was 4.008,9. There was a certain gene exchange between the 4 groups. The genetic variation among the 4 populations was 5.87%. In addition, 94.13% of the genetic variation was produced by individual differences. . Population gene flow BM2133 loci maximum (7.096,5), BM1824 loci minimum (2.112,8), Gene flow was not the key factor to the genetic structure of Xinjiang brown cattle population. Cluster analysis showed that the 4 groups could be divided into two groups according to the genetic distance.【Conclusion】The four breeding population of Xinjiang Brown Cattle has rich genetic diversity which can be used as cattle breeding new varieties and new types.

Xinjiang Brown Cattle; genetic variation; microsatellite loci; polymorphism information content; heterozygosity; alleles; genetic structure

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.024

2016-02-21

自治区科技重大专项课题“新疆肉牛新品种(系)培育与杂交改良技术研究示范”(201230116-10)

周振勇(1980-)，男，新疆人，高级畜牧师，研究方向为肉牛繁育，(E-mail)77790468@qq.com

张杨(1962-)，男，河北人，研究员，研究方向为肉牛遗传育种，(E-mail)zhyang1962@126.com

S823.3

A

1001-4330(2016)07-1356-08