韩 燕 刘宏业 尹跃平 龚匡隆 钟铭英 朱小宇 施美琴

新西兰兔接种梅毒螺旋体后主要器官病理表现

韩 燕 刘宏业 尹跃平 龚匡隆 钟铭英 朱小宇 施美琴

目的: 观察接种不同代数的菌株及不同药物剂量组治疗后的梅毒兔主要脏器的病理改变。方法: 睾丸接种组选择原代组、一代组、二代组及阴性对照组各1只进行解剖，取心、肝、脾、肾。背部皮肤的接种组药效学评价选择阳性对照家兔1只、普鲁卡因青霉素和头孢曲松中间两个剂量组治疗的家兔各1只，解剖心、肝、脾、肾，10%福尔马林溶液固定、包埋、切片和HE染色。结果: 梅毒螺旋体感染家兔后2周，可引起心、肝和肾炎症细胞的浸润，但不引起脾脏的病理改变。一代组及二代组引起脏器的炎症改变与原代组相似。梅毒感染后的家兔药物治疗后12周，部分梅毒兔主要脏器仍有炎症反应，头孢曲松治疗RPR滴度转阴11周后家兔的心、肝及肾脏无明显炎细胞浸润。结论: 在进行梅毒兔药效学模型建立过程中无需增加病理学的数据，但在治愈转阴后通过病理切片的观察能够更好地了解治疗效果。

梅毒螺旋体； 新西兰雄兔； 感染模型； 病理表现

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum，Tp)引起的慢性、系统性性传播疾病。在我国梅毒已超过淋病成为最为常见的性传播疾病，至2013年，梅毒报告发病率已达32.86/10万，居全国甲、乙类法定传染病第3位，成为我国重要的公共卫生和社会问题之一[1]。由于缺乏梅毒疫苗，青霉素成为控制梅毒的主要有效药物，一般人群青霉素过敏率为8%左右[2]，青霉素类药物治疗后仍有1%～2%的概率会发生药物副反应[3]。因此选择对青霉素药物过敏及治疗后有副反应的人群选择合适的替代药物进行梅毒治疗显得尤为重要。动物感染模型的建立有利于对抗梅毒药物进行合理、有效的药效学评价，而病理观察作为重要的评价指标之一显得尤为重要。梅毒的家兔模型与人类的梅毒感染有很多相似之处。将梅毒螺旋体接种于家兔的睾丸中可以获得大量的梅毒螺旋体[4]，而背部皮内接种引起的临床表现类似于人类一期梅毒硬下疳的表现[5，6]，适合与药效评价时模拟人类梅毒发病情况的观察。因此本研究通过睾丸接种进行传代扩大培养的同时观察家兔接种不同代数的菌株后各主要脏器的病理改变，探讨接种不同代数的菌株对兔梅毒模型的影响；利用背部皮肤的接种梅毒螺旋体建立梅毒兔药效观察模型，并利用不同的药物剂量进行疗效对比，初步观察不同药物剂量组治疗梅毒后主要脏器的病理改变，初步探索病理在梅毒兔治疗效果评价中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 纯种新西兰雄兔购于南京金陵种兔场[scxk(苏)2012-0003]，体重2.8～3.5 Kg，兔龄3个月左右，饲养于IVC兔笼中，饲料(南京青紫兰生物科技有限公司)及饮水均不含抗生素。

1.2 菌株 Nichols标准株由美国华盛顿大学过敏和传染病实验室惠赠，传代保存于中国医学科学院皮肤病医院参比实验室。

1.3 试剂 10%福尔马林溶液由1份37%～40%甲醛(西陇化工股份有限公司，广东汕头)与9份双蒸水配置而成。正常家兔血清盐溶液5(NRS盐溶液，生理氯化钠溶液与正常家兔血清混合)为实验室自制。

1.4 实验方法

1.4.1 梅毒螺旋体菌悬液制备 将液氮中保存的Nichols标准株的梅毒兔睾丸模型，在37℃孵箱中复苏1 h后，将睾丸沿纵线方向切成多个小片，但不完全切开，后放入装有10 mL 20%的NRS盐溶液，利用无菌纱布盖住烧杯后，水平摇晃烧杯使液体与睾丸的切片充分接触，并用眼科镊对睾丸切片进行充分挤压，从而充分释放睾丸组织中的梅毒螺旋体。取一定量的菌悬液置于载玻片上，盖上盖玻片，置于暗视野显微镜下计数，并利用20%NRS盐溶液进行稀释后暗视野显微镜下每个视野约50个梅毒螺旋体用于睾丸接种组，暗视野显微镜下每个视野约120个梅毒螺旋体用于背部皮内接种组。

1.4.2 菌悬液的接种 家兔称重后根据随机数字将其随机分为睾丸接种组和背部皮内接种组。实验前均进行血清学检测以排除梅毒螺旋体的感染。睾丸接种组:利用安尔碘消毒双侧睾丸，双侧接种，总注射2×107梅毒螺旋体。根据接种螺旋体菌株的代数的不同，分为原代组、一代组和二代组。背部皮内接种组:背部剃毛后选择6个点接种，总注射2×107梅毒螺旋体[7，8]。 1.4.3 药物治疗 选择普鲁卡因青霉素和头孢曲松作为治疗药物，根据临床药物的治疗剂量(普鲁卡因青霉素80 UI连续10天；头孢曲松500 mg连续10天)和人与动物及各类动物间药物剂量的换算公式d2＝d1R2/R1(W1/W2)1/3(d为动物的每 kg体重剂量；R为动物体型系数；W为动物的体重)得家兔的普鲁卡因青霉素剂量为3.4 UI/kg，头孢曲松剂量为21 mg/kg。对比文献后实验中选择推算的剂量的原倍、1/5、1/25和1/125共四组。当70%的家兔血清滴度连续3周无变化时，臀部肌肉注射药物，连续10天。

1.4.4 组织学观察 睾丸接种组在两周后利用空气注射处死实验家兔。各选择原代组、一代组及二代组及阴性对照组各1只进行解剖，取家兔心脏的心尖、左侧肝叶、脾脏的左侧、左肾组织。背部皮肤的接种药效学评价在药物治疗后12周利用空气注射处死实验家兔。选择阳性对照家兔1只、普鲁卡因青霉素和头孢曲松中间两个剂量组治疗的家兔各1只进行解剖，取其心脏的心尖、左侧肝叶、脾脏的左侧、左肾组织。10%福尔马林溶液充分固定后，送东南大学病理教研组经过脱水、透明、浸蜡、包埋和切片后厚度4 μm，进行HE染色镜检。由专业病理人员在光学显微镜下阅片。

2 实验结果

2.1 感染不同接种代数梅毒螺旋体后家兔主要脏器的病理学改变 阴性对照组:心、肝、脾、肾各组织内无明显炎细胞浸润，未见明显病变(图1)。原代组:心肌内可见灶性淋巴细胞散在浸润；肝汇管区内较多的淋巴细胞及少许巨噬细胞浸润；脾未见明显病变；肾髓质区有淋巴细胞浸润(图2)。一代组及二代组:心肌内可见灶性淋巴细胞散在浸润；肝汇管区内较多的淋巴细胞浸润；脾未见明显病变；肾髓质区有淋巴细胞浸润。

梅毒螺旋体感染家兔后2周，可引起心、肝和肾这些主要脏器的炎症改变，但是不引起脾脏的病理改变。一代组及二代组引起的脏器的验证改变与原代组相似。

2.2 不同药物不同剂量治疗梅毒螺旋体感染的家兔的主要脏器的病理学改变 阴性对照组:心、肝、脾、肾各组织内无明显的炎性细胞浸润，未见明显病变。阳性对照组(治疗前RPR滴度为1∶32，处死前1∶8)病理表现与同上述的原代组表现相似。普鲁卡因青霉素治疗组:0.68 UI/kg组，治疗前RPR滴度1∶4，治疗后第7周转阴；0.136 UI/kg组，治疗前RPR滴度1∶16，处死前1∶4。两组病理切片结果相似:心肌内可见灶性淋巴细胞散在浸润；肝汇管区内较多的淋巴细胞及巨噬细胞浸润，并侵及小叶间胆管；肾间质部分血管周围有大量淋巴细胞并伴有少许巨噬细胞浸润，还可见灶性间质有大量淋巴细胞浸润。

图1 对照组各主要脏器的组织学表现病理图

图2 原代组各主要脏器的组织学表现病理图

头孢曲松治疗组:4.2 mg/kg组，治疗前RPR滴度1∶16，处死前1∶1；而0.84 mg/kg组，治疗前RPR滴度1∶2，治疗后第二周转阴；未转阴者心肌内无明显炎细胞浸润，未见明显病变；肝汇管区内较多淋巴细胞及少许浆细胞、巨噬细胞浸润；肾可见肾间质少数血管周围有少量淋巴细胞及巨噬细胞浸润。转阴后11周者:心、肝、脾、肾各组织内无明显炎细胞浸润，未见明显病变。

普鲁卡因青霉素治疗RPR滴度转阴后6周家兔的心、肝及肾脏的炎症仍存在；头孢曲松治疗RPR滴度转阴后11周家兔的心、肝及肾脏无明显炎细胞浸润，未见明显病变。

3 讨论

梅毒螺旋体不易在体外培养，但可在猿猴、白鼠、仓鼠、豚鼠和家兔体内得到很好的繁殖。大量研究显示家兔是研究梅毒很好的模型，经睾丸接种可以对梅毒螺旋体进行扩大培养，而经背部皮肤接种可以很好的模拟人感染梅毒后一期的临床症状[8]。梅毒感染初期组织学特征是单核细胞浸润，在感染第6天，即有淋巴细胞浸润，13天达高峰，随之巨噬细胞出现，病灶中浸润的淋巴细胞以T细胞为主。大约经6～8周，大量螺旋体进入血液循环，向全身播散。研究显示在家兔感染大量的梅毒螺旋体(2×107)，3～4周即可引起全身炎症损害[9]，在本研究中显示接种梅毒螺旋体后2周所有睾丸接种组的家兔均出现心、肝、肾的炎症反应。但在原代组和一代组及二代组之间没有差异，而本研究组对原代梅毒螺旋体接种家兔2周后，原代组血清RPR的滴度比一代和二代的滴度低[7]，这可能与病理的改变的量化效果较差，因此不能够敏感的反应之间的不同有关。

背部皮肤接种梅毒螺旋体组经药物治疗后较长一段时间内，其主要器官的炎症未能完全清除，其中RPR未能转阴及RPR转阴6周其主要器官的炎症仍然存在，而RPR转阴11周后，其主要器官方才无明显炎性细胞浸润，未见明显病变。提示梅毒感染后血清RPR滴度转阴后可能需要很长一段时间(6～11周)其心肝肾的炎症反应才能完全清除。因此病理观察可以进一步了解疾病的发生发展情况，但是缺乏量化的指标，反应不够灵敏，且需要组织切片，操作复杂，对于动物的损伤较大，因此在进行梅毒兔药效学模型建立过程中无需增加病理学的数据，但在治愈转阴后通过病理切片的观察可以进一步验证能更好地了解治愈的效果。

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Pathological changes ofm ajor organs in New Zealand rabbitmodels inoculated w ith Treponema pallidum

HAN Yan，LIU Hongye，YIN Yueping，GONG Kuanglong，ZHONGMingying，ZHU Xiaoyu，SHIMeiqin.
Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

Objective:To investigate the pathological changes ofmajor organs in rabbitmodels inoculated with Treponema pallidum which has different continuous passages and is treated with different drugs and doses. M ethods:One New Zealand rabbitwas selected to bedissected.The heart，liver，spleen and kidney from primary，first and second generation group and negative control group in testis-inoculated groups were used for the pathological examination.In dorsal skin-inoculated groups，these organswere taken from one rabbitselected from positive control group，two doses of procaine benzylpenicillin and ceftriaxone sodium groups.After fixed by 10%formalin solution，these organs were dehydrated，paraffine-embedded and sliced for HE staining.Results:After infected with Treponema pallidum for two weeks，the heart，liver，and kidney tissue of the rabbitwere infiltrated within flammatory cells，but no pathological changeswere observed in spleen tissue. And also there were no significant difference in the inflammatory changes of the organs between the three passages of Treponema pallidum.After treated with drugs for12 weeks，somemajor organs of the rabbitwere infiltrated with inflammatory cells，butno obvious infiltration of inflammatory cellswere observed in these tissue of the infected rabbit treated with ceftriaxone sodium after the RPR titerwas negative for 11 weeks.Conclusion: Pathologic observation is not essential for pharmacological evaluation，but the results can verify the efficacy of the treatment.

Treponema pallidum；New Zealand rabbit；infected models；pathologic change

中国医学科学院北京协和医学院皮肤病医院，南京，210042

尹跃平，E-mail:Yinyp@ncstdlc.org