魏洪吉

【摘要】 目的 探讨基因沉默整合素连接酶（ILK）对胰腺癌细胞（Panc-1）上皮向间质转化（EMT）的影响。方法 培养Panc-1细胞， 构建ILK-specific-shRNA慢病毒载体后， 再行转染Panc-1细胞， 通过Western-blot技术验证感染基因的有效性， 同时比较Panc-1细胞上皮向EMT转化标志性蛋白E-钙连蛋白（E-cadherin）表达情况。结果 ①基因沉默ILK明显的抑制了Panc-1细胞的迁移、侵袭能力， 且阳性组细胞迁移率和侵袭率均为（0.15±0.03）， 明显低于阴性组（0.43±0.02）， 差异具有统计学意义（t=23.572， P<0.01）。②SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电脉法（SDS-PAGE）结果：E-cadherin的条带为122～141 KD， GAPDH为37 KD的条带。siRNA慢病毒转染Panc-1细胞后KD组E-cadherin表达为（0.545±0.011）， 明显高于阴性组（0.079±0.004）， 差异有统计学意义（t=28.942， P<0.01）。结论 基因沉默ILK转染后， 明显抑制Panc-1细胞迁移、侵袭能力， 显著上调E-cadherin 表达， 逆转了EMT 的发生。

【关键词】 基因沉默；整合素连接酶；胰腺癌细胞；上皮向间质转化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.194

胰腺癌发病率占常见恶性肿瘤的1%～2%， 死亡率高[1]。由于多数患者在确诊时己发生癌细胞转移， 无法进行胰腺切除手术， 只能采用化疗、放疗等姑息治疗手段， 随之产生的副作用严重降低了患者的生活质量。寻找新的治疗思路迫在眉睫。ILK是一种细胞内信号蛋白， 是多种致瘤相关因素的上游交叉点， 与肿瘤的形成、增殖、凋亡、转化和侵袭转移密切相关[2]。因此， 研究ILK对胰腺癌细胞EMT的影响可能是一种新的治疗思路。

1 材料与方法

1. 1 材料 人胰腺癌Panc-1细胞株购自中国科学院细胞库；兔E-cadherin抗体、ILK多克隆抗体、BCA蛋白定量试剂盒、增强化学发光试剂、PVDF膜等购自武汉博士德生物工程有限公司；低温高速离心机购自德国Heraeus公司产品；转膜电泳槽购自美国 Bio-Rad 公司；PCR仪（PE2400）购自美国Perking Elmer公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 ILK-specific shRNA 慢病毒载体的构建 针对目的基因序列， 采用siSearch和sFold两种在线设计软件设计核苷酸序列[3]。将自行合成的含干扰序列的双链DNAoligo两端含酶切位点的粘端连入酶切后的RNA干扰载体上， 再转入制备好的细菌感受态细胞， 对长出的克隆先进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定， 测序比对， 鉴定阳性即构建成功。……