胡玲玲，汤德元，曾智勇，黄 涛，李 达，韦冠东，龙冬梅

( 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型及链球菌混合感染的诊断

胡玲玲，汤德元*，曾智勇，黄 涛，李 达，韦冠东，龙冬梅

( 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

2016年3月贵州省某规模化猪场的保育猪相继出现四肢无力，趴地不能站立，叫声嘶哑，死亡率高。经临床检查和实验室诊断确诊为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和链球菌混合感染。现将诊断结果报道如下：

1 发病情况

该规模化猪场存栏猪1 000余头，2016年3月中旬开始在2～3月龄保育猪出现发病，呈叫声嘶哑、体温升高、眼缘肿大、四肢无力、趴地不能站立，并不断出现死亡现象；截止3月下旬共31头猪发病，死亡18头，另外13头表现出相同的症状。

2 临床症状

发病猪精神沉郁、食欲减退，消瘦，皮肤苍白，叫声嘶哑，体温升高至40～41 ℃，四肢无力，走路摇晃，趴在地上不愿站立，外阴肿大，大腿内侧及腹部皮肤出现针尖状出血点。发病特点为：发病急、病程短、死亡率高。初步怀疑为病毒性疾病和细菌性疾病混合感染。

3 病理剖检变化

无菌剖检病死猪的病理变化为：剖检腹腔可见肠道严重充气（图1），肠系膜淋巴结部分肿大及充血，肝脏边缘梗死（图2），脾脏有大量瘀斑、边缘呈锯齿状（图3），胃底黏膜有出血、溃疡灶（图4）、心脏包膜有积液，肺部可见大量严重坏死病、严重充血、淤血（图5），肠道黏膜出、充血现象明显（图6），膀胱黏膜有针尖大的出血点。

图1 肠道充气

图2 肝脏边缘梗死

图3 脾脏边缘锯齿状

图4 胃黏膜溃疡灶

图5 肺部可见明显充血、坏死

图6 肠道出血

4 实验室诊断

4.1 细菌分离鉴定

4.1.1 细菌分离培养

无菌条件下将病猪的血液、肺脏和肝分别接种于鲜血琼脂培养基上，于37 ℃条件下需氧/厌氧培养24～72 h观察。结果培养基在需氧和厌氧环境下均有菌落生成长，判定分离菌为兼性厌氧菌。细菌在普通营养琼脂平板上生长贫瘠，培养24 h后有针尖大小的单个菌落出现。然后挑取单个菌落进行纯培养，同时对细菌进行涂片、革兰氏染色后经1 000倍油镜镜检有大量蓝紫色圆形、双球形或短链状革兰阳性球菌（图7）。

图7 10x100倍油镜下可见单个或成链状的球菌

4.1.2 生化鉴定

用杭州百思生物技术有限公司的BS7009球菌生化试剂盒检测，结果表明：厌氧条件下培养的细菌对葡萄糖、蔗糖、果糖、覃糖、麦芽糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇以及N-乙酰葡胺试验呈阳性；木糖醇及硝酸盐还原试验呈阴性；需氧条件下培养的细菌对蔗糖、蜜二糖、果糖试验呈阳性；麦芽糖、乳糖、甘露醇、甘露糖、木糖醇、山梨醇、覃糖、N-乙酰葡胺及硝酸盐还原试验呈阴性；鉴定结果符合链球菌的生化特性。

表1 扩增目的片段的引物

4.2  病毒核酸检测

4.2.1 病料处理及DNA/RNA的提取

将送检的死猪解剖分离各个器官，分别将心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及淋巴结进行取样研磨，反复冻融3次，再用匀浆器进行匀浆收集其匀浆液，再取其血液，10 000 r/min离心10 min取其上清液进行DNA/RNA的提取，严格按照TaKaRa MinBEST Vira1 RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0说明书一步法提取DNA/RNA。

4.2.2 引物设计与合成

根 据GenBank中 登 录 的PRV gB（AF257079）、PRVgE（JX417716）、PCV2 ORF2（NC_005148）、CSFV C（AY805221）、PRRSV ORF6(NC_001961)、PPV NS1(NC_001718) 和 SIV M(GU086140)等 基 因 序 列， 应 用DNAStar、O1igo、MPprimer各设计了1对引物，用于扩增目的基因片段，引物均由上海英潍捷基贸易有限公司合成。引物序列见表1。

4.2.3 PCR/RT-PCR反应

对提取的核酸分别进行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PPV和SIV的病原检测，各反应体系及条件如下：CSFV、PRRSV和PCV2反应体系：2×1 Step Buffer 12.5 μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL，上下游引物各1 μL，RNA模板2 μL，RNase Free H2O 7.5 μL， 总 体 积25 μL。反应程序50 ℃ 40 min；94 ℃5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PRV反应体系： 2×GC Buffer 12.5 μL，dNTPs (10 mmo1/L) 1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板各2.0 μL， Taq DNA聚 合 酶 1.0 μL，RNase Free H2O 6.5 μL，总体积25 μL。反应程序为：94℃ 5 min；94 ℃ 1 min； 58 ℃ 1 min；72 ℃ 45 s； 35个循环；72 ℃10 min。PPV和SIV反应体系： 2×1 step buffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板3 μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1 μL，RNase Free H20 6.5 μL，总体积25 μL。PPV反应程序95 ℃5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，35个循环；72 ℃10 min。SIV反应程序50 ℃40 min；95 ℃5 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，35个 循 环；72 ℃10 min。

图8 PCR/RT-PCR检测结果

4.2.4 PCR/RT-PCR检测结果

各取5 μL PCR/RT-PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。检测结果如图8所示：

如图8所示检测出猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型特异性病原核酸阳性条带，测序结果与预期相符，确诊为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型感染。

5 诊断结果

根据临床典型症状，结合流行特点、病理剖检和实验室细菌分离鉴定以病毒及PCR/RT-PCR检测，确诊该猪场猪发病原因为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型和链球菌混合感染引起的发病死亡。

6 讨论

随着我国养猪业规模化、集约化的不断发展及治疗猪病手段的不断进步，随之而来的疾病的种类也产生了变化，由以往的单一病原致病发展到多种病原混合感染和继发感染。虽然药物治疗手段和效果越来越好，但随之猪病的复杂程度及其危害也与日俱增。这对我们兽医工作人员是一个极大的挑战。CSFV和PRRSV是病毒性疫病的重要病原，CSFV、PRRSV能够损伤机体的免疫系统，降低猪群对外界环境的抵抗力，使得猪群发生疾病时多种病原混合感染和继发感染的情况越来越普遍，由于这些病毒给机体造成相似临床症状，导致疾病的诊断十分困难，难以及时给予相应的防治。目前在临床上多见CSFV与其他病毒或细菌的混合感染使病情复杂，临床上或不呈现典型症状，增大了临床诊断的难度，同时也增大了猪群的发病率和死亡率，应引起重视。

链球菌病是由链球菌感染引起的，我国部分省区时有发生。链球菌不仅可以侵入血液循环系统，而且可以穿过血脑屏障和胎盘屏障导致脑膜炎及母畜流产。在健康猪的体内、血液循环系统、肝脏、肾脏、脾脏、脑脊液等器官和体腔内是无病原体存在的，只有与外界相通的呼吸系统、消化系统等有大量的微生物存在，当猪所在环境条件差，如夏季温度过高，湿度大，通风不畅；冬天寒冷潮湿，温差大；饲养管理不善，没有规范的消毒措施，没有严格的免疫程序，缺乏保健措施；以及饲料营养不平衡，有发霉变质现象等，使猪机体处于应激状态，特异性、非特异性免疫反应就会受到抑制，机体防御屏障被打破，从而容易受到病原体侵入，疾病进入潜伏期或者表现出临床症状，如果没有及时改善不利因素同时做出对病情的诊断和治疗，病原体会大量增殖，进入血液循环系统，到达各脏器并造成损伤。

建议猪场做好环境卫生消毒工作，首先对发病猪进行隔离饲养；对检测有PCV2感染的猪进行淘汰；对病死猪进行深埋或焚烧处理；对污染的圈舍和四周环境用2%的烧碱液进行严格消毒。针对该规模化猪场出现PCV2的感染严重并出现仔猪死亡现象，该规模化猪场健康猪应紧急接种猪圆环病毒2型灭活疫苗。待疫情稳定1个月后，对猪场内所有猪进行猪瘟和猪蓝耳病的常规免疫。

2016-09-08）

贵州省科学技术基金项目资助(黔科合J字［2013］2110号)；贵州省2014年农业攻关项目资助(黔科合NY字［2014］3055号)

胡玲玲(1993-)，女，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子生物学的科研学习

*通讯作者：汤德元（1964-），男，教授，博士，硕士生导师，主要从事动物传染病病原分子生物学和中西兽医结合的教学科研工作。E-mail：tdyuan@163.com