牛巧丽，孙玉亮，努尔比亚木·麦麦提依明，赵 今

（新疆医科大学第一附属医院牙体牙髓科 新疆 乌鲁木齐 830054）

HMME—PDT联合氟制剂预防龋病的动物实验研究

牛巧丽，孙玉亮，努尔比亚木·麦麦提依明，赵 今

（新疆医科大学第一附属医院牙体牙髓科 新疆 乌鲁木齐 830054）

目的：在构建龋病动物模型基础上观察HMME-PDT联合氟制剂预防龋病的效果。方法：选取断奶21d SPF-Wista大鼠80只，种植变形链球菌构建致龋模型后分为蒸馏水、HMME-PDT、氟化钠、以及HMME-PDT+氟化钠组4组，连续8周给大鼠进行口腔处理，采集大鼠唾液培养，记录变形链球菌水平及观察实验组大鼠口内变形链球菌生长繁殖的影响并评估Keyes记分抑制龋损形成的效果。结果：与蒸馏水组相比，其余各组变形链球菌水平和龋齿Keyes记分均有不同程度的降低,其中HMME-PDT显示对窝沟面龋和光滑面龋有较好的防治效果（P＜0.05)，但均低于氟化钠组；HMME-PDT +氟化钠组未见明显的协同抑龋作用。结论：HMME-PDT能有效抑制口腔变链菌繁殖，降低龋齿的发生率。

龋病；HMME-PDT；动物模型；变形链球菌；氟制剂

龋病是在以细菌为主的多因素作用下牙体的慢性感染性疾病，其发病率高，在众多口腔疾病中屈居首位，危害广泛，严重影响人们的生活质量，以此寻找到根源进行有效地预防就显得尤为重要。光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是利用特定波长的光激发光敏剂产生光化学效应，抑制致病细菌，从而起到预防疾病的一种新型疗法。它操作简便，可有效治疗细菌性疾病而不引起菌群的紊乱等优势备受国内外学者广泛的关注。本研究在构建致龋动物模型的基础上初步探讨HMME介导的光动力疗法对口腔内主要致龋菌变形链球菌的杀伤效果，以及其对龋病发生发展过程的影响。

1　材料和方法

1.1主要仪器和试剂：电热恒温培养箱、厌氧培养箱、欧式圆形压力蒸汽灭菌器、净化工作台、电子天平、振荡器、光学显微镜、解剖显微镜；超薄型磨片、氨苄西林胶囊、头孢拉定胶囊、皮罗卡品；紫脲酸铵指示剂、氟化钠，半导体激光，40mg/L的HMME光敏剂。

1.2动物和饲料:SPF-SD大鼠80只；致龋饲料2 000#组成成分[1]。

1.3致龋菌选择:变形链球菌(Streptococci mutans25175)国际标准株、牛心脑浸液琼脂(BHI琼脂)，轻唾琼脂培养基(MS琼脂)、杆菌肽、无菌脱纤维蛋白羊血。

1.4实验分组:HMME-PDT组，HMME-PDT+NAF为实验组；蒸馏水组为阴性对照组，NAF组阳性对照组。

1.5实验方法:选取出生后21d 断奶SPF-Wista大鼠80只，雄性，称重，喂以致龋饲料2 000#和5%蔗糖水溶液，连续3d在1 000g饲料加氨苄西林1g，1 000g 5%蔗糖水溶液加头孢拉定1g来抑制大鼠口内内源性变形链球菌，鼠龄24d时无菌下采集大鼠唾液培养检测抑菌情况。连续4d于大鼠口腔内接种变形链球菌（1ml/只)，在26～28d随机抽取10只大鼠，标定，乙醚吸入麻醉下，采集唾液（100μl/只），稀释涂平板，37℃厌氧培养，检测细菌是否定植，并记录菌落形成单位，观察细菌生长情况。29d为洗脱期，对大鼠随机分组，编号记录体重。30d选择波长532nm、功率34mw的半导体激光和40mg／L的HMME光敏剂，将80只大鼠随机分为4组：照射时间90s的PDT组、PDT+NAF组、0.2%NAF阳性对照组、0.9%生理盐水阴性对照组，每组20只大鼠。鼠龄30d按照实验分组进行干预，实验组局麻下，固定大鼠口腔牙齿涂布光敏剂孵育5min，照射后用消毒棉拭子在牙齿颌面上由同一实验者按照顺时针方向擦拭牙面一圈。将棉拭子按不同组别放入到5ml的离心管里，3 000r／min，震荡2min，然后连续稀释，取悬浮液涂布在TSA培养平板上37℃，恒温厌氧培养箱培养48h，观察结果。按以上方法处理大鼠1次/W，检测结果，连续8w（该操作均有同一人进行操作）。鼠龄86d时，实验分两步采集样本：①每组选取5只大鼠4%多聚甲醛液心脏灌注内固定处死，取双侧下颌骨（连同建模牙及其牙周组织），甲醛固定，甲酸脱钙，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，制成通过颊舌向5um厚的组织切片，HE染色，在光学显微镜下观察各组大鼠牙周组织的病理变化；②处死剩余各组大鼠、断颅，将其头颅置于高压蒸汽锅中，0.1kPa处理5min，去除软组织，分离上下颌骨，用清水清洗干净，室温干燥保存。将干燥的颌骨置于0.4%紫脲酸铵染色液中浸泡12h，取出后用清水冲洗干净，室温干燥，棕色瓶保存。以实验分组为单位拔除大鼠各个牙齿，制作磨片，在光学显微镜下，根据Keyes经典评分方法评估大鼠磨牙患龋情况。

1.6统计处理:实验数据采用SPSS15.0 统计软件包进行单因素方差分析，比较计算各组数据F值，再进行多组样本均数两两比较的SNK、Dunnett检验和LSD检验（检验水准a=0.05）。

2　结果

2.1大鼠的一般状况和牙周组织情况：从实验中1～62d大鼠的食物、水消耗量进行记录，各组大鼠间未见明显差异。大鼠的一般状况良好，各组大鼠的体重均匀增加且无显著差异（P＞0.05)（表1）；肉眼观察大鼠口腔黏膜无溃疡、糜烂，牙龈颜色、形态和质地均正常，组织切片显微镜下观察牙龈上皮和结缔组织均无病理性改变，牙槽骨无破坏，说明HMME-PDT经口腔局部应用在实验周期内的安全性。实验结束后蒸馏水组大鼠不同牙面龋坏标本示意图（图1、2）。

表1　整个实验过程中不同组大鼠体重随时间的变化情况 （n=20,g）

2.2变形链球菌水平：与蒸馏水组相比，其余各组变形链球菌水平值与比均有不同程度的降低，只有氟化钠组有统计学差异（P＜0.05)（表2）。

表2　不同组实验结束时大鼠唾液中变形链球菌水平 (n=20,CFU／ml)

2.3大鼠磨牙龋损的Keyes评分：Keyes评分[1]是一种龋齿评分系统，始创建于1958，常应用于大鼠的致龋动物模型中，能有效，客观的评估龋损信息，其科学性已被广泛认可。它是单个牙面龋损范围和以四种方式记录探诊深度来评估大鼠的龋损（累及釉质E、牙本质浅层DS、牙本质中层DM、牙本质深层DX），其中E级记分反映龋损累及广度，DS、DM、DX级记分反映龋损累及的牙本质深度，两者共同反映了龋损的严重程度。

2.3.1光滑面龋Keyes记分：与蒸馏水组相比，①在E级记分中其余各组记分均有降低，且有明显的统计学意义（P＜0.05)，显示出对预防大鼠釉质龋发生有较好的防治作用；②在Ds记分中，只有HMME-PDT+氟化钠组检出，剩余组均未检出。HMME-PDT+氟化钠组的龋齿记分与蒸馏水组相比有所降低，但并无统计学差异（P＞0.05)，显示HMMEPDT和氟化钠两者均有良好的预防深度龋损的效果，但两者联合应用时协同作用不明显（表3）。

表3　不同组实验结束大鼠磨牙标本中光滑面龋Keyes记分 (n=20)

2.3.2窝沟龋Keyes记分：与蒸馏水组相比，①在E级记分中，其余各组龋记分均有明显降低，且有统计学意义（P＜0.05)；②在Ds、Dm级龋齿记分中，其余各组的龋记分与蒸馏水组相比有明显减轻，且统计学差异显著（P＜0.05)；③在Dx级龋齿记分中，HMME-PDT+氟化钠组的龋记分与蒸馏水组比较有所降低，有统计学差异（P＜0.05)，氟化钠组和HMME-PDT组均未检出（表4）。

表4　不同组实验结束大鼠磨牙标本中窝沟面龋Keyes记分 (n=20)

2.4实验结束后蒸馏水组大鼠不同牙面龋坏标本示意图：见图1、2。

图1　蒸馏水组大鼠磨牙标本（窝沟龋）

图2　蒸馏水组大鼠磨牙标本（光滑面龋）

3　讨论

龋病是一种内源性的感染性疾病，是口腔的常见病和多发病，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。现有防龋方法均存在一定的局限性，例如洗必泰的存在耐药性和过敏性、氟化物的长期使用产生慢性毒副性作用以及免疫防龋方法的不确定性，迄今尚无简便可重复、效果明确、毒副作用轻微、易广泛接受的防龋措施。因此，寻找安全、有效、经济的防龋方法迫在眉睫。

光动力疗法(photodynamic therapy,PDT）是近年来发展起来的有较好应用前景的一种新型临床治疗方法。它是激光技术、光纤技术、光信息处理技术、生物光化学技术和现代医学技术等有机结合，利用一定波长的激光照射，使光敏剂受到激发，产生细胞毒素，导致细胞的死亡和组织破坏，达到治愈疾病的目的。由于其独特的光学性能，在口腔领域受到人们越来越多的关注[2-4]。所有致龋菌都是正常状态下存在的口腔常驻菌群，变形链球菌和乳酸杆菌具有较强的产酸和耐酸能力，是公认的致龋菌[5]，故将该菌作为本实验的致龋菌。2010年国外学者在体外实验的基础上发现PDT对伴放线杆菌[6]、口腔生物膜致龋变形链球菌[7]和粪肠球菌[8]等多种细菌有明显的杀伤作用，这就需要我们用致龋动物模型模拟口腔内环境来进一步证实。还有研究表明光敏剂分子带有正电荷，能迅速与细菌细胞结合并穿透胞膜进入细胞内部，其与细菌细胞的结合能力远强于与哺乳动物体内细胞的结合能力，因此PDT表现出对组织表面或组织内细菌的选择性杀灭作用，而对正常组织细胞影响较小，可以重复进行多次治疗[9-10]。国外研究也证实PDT对致龋菌具有直接的杀灭作用，对正常组织无明显毒副作用而且不会产生细菌耐药性[10]。本实验中对于大鼠的一般情况观察和大鼠口腔黏膜无溃疡、糜烂，牙龈颜色、形态和质地均正常，组织切片显微镜下观察牙龈上皮和结缔组织均无病理性改变，牙槽骨无破坏，也应证这一点。有学者们推断光动力疗法适合用于龋病的防治，临床上可使用注射器等工具将光敏剂涂布于龋损部位，再进行光投照 ，来达到杀灭致龋微生物的目的[12]。此外，王冬青[11]等发现PDT不但在龋病预防和阻止龋病发展进程领域有较好的应用前景,而且能有效清除牙周病及种植体周围疾病的病原菌，达到牙周的治疗目的。

理想的光敏剂具有以下优点：靶向性强，选择性高，光毒性强、吸收光的波长长，在体内快速消除，局部使用安全等特性。血啉单甲醚(HMME)是我国自主研发的一种新型光敏剂，其纯度高(98%)、单态氧量子产率高、避光期短及组织选择性好。HMME有多个特征吸收峰，其吸收峰(nm)：397(soret)、498、532、620等，实验选择了其特征吸收峰所处的53的半导体激光作为光源，因其具有体积小、激光输出稳定、寿命长、出光快、价格适中等优势，被广泛应用于临床治疗中[13],实验中我们以HMME为光敏剂，输出功率为34mW，功率密度为0.14W／cm2，波长为532am的半导体激光器照射，结果显示PDT对口腔内致龋细菌有很强的杀菌效果，显著高于对照组。还有金花[14]等学者研究发现HMME与细菌作用后，G+菌比G-菌更易于被HMME光动力杀灭，膜损伤是HMME致细菌光动力失活的主要机制，HMME选择性地滞留于细菌细胞壁和细胞膜上，激光照射时产生单态氧和其它活性氧直接损伤细菌细胞壁及膜系统，导致细菌死亡。李敏[15]等发现研究40ng／L HMME-PDT组的大鼠磨牙面上的细菌数最少，明显低于10ng／L、20ng／L HMMEPDT组，40ng／L HMME-PDT组表现出来的杀菌效果更为明显，原因可能是因为光敏剂浓度大时，细菌能够迅速地摄取光敏剂，在相同的光强度下，被激发的光敏剂产生的单态氧多，杀死的细菌数越多。

与传统的防龋治疗方法相比，HMME-PDT疗法存在下列优势：①防龋操作可复制且简单方便；②选择性的杀灭口腔致龋细菌，局部使用安全性高；③口腔内长时间使用不产生耐药性，不会引起菌群紊乱，灵敏度高；国内多数研究也有应证。但它也存在着潜在的不足，我们应严格掌握光敏剂的使用剂量、光照强度、时间等因素，控制产生的活性氧分子数量，才能更好的应用于临床治疗中。

综上所述，从目前研究发现使用HMME-PDT不但达到了预防龋病的效果，而且其可以有效作用于致龋微生物而不产生耐药性，局部使用安全不伤及正常牙周黏膜，在预防龋病方面显露出独特的优势。在不远的将来，血卟啉单甲醚介导光动力疗法将会成为龋病的预防的另一种新途径。

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编辑/张惠娟

Animal experimental study of HMME - PDT combined with fluoride to prevent dental caries

NIU Qiao-li,SUN Yu-liang,Nuerbiyamu·maimaitiyiming,ZHAO Jin
(Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,Xinjiang,China)

Objective To observe the effect of hmme-pdt combined with fluoride to prevent dental caries in animal model, Based on the construction of dental caries. Methods Select 21d weaning SPF-Wista rats 80, the planting of Streptococcus mutans to construct cariogenic model is divided into distilled water, hmme-pdt, sodium fluoride, and hmme-pdt+sodium fluoride group 4 groups, continuous 8W to rats by oral treatment collected rat saliva culture, record deformation levels of Streptococcus and observe the experimental group rats in the mouth of the deformation of the streptococcal growth effects on the reproductive and assessment scores of Keyes inhibitory effect on the formation of dental caries. Results Compared with the distilled water group and other groups deformation streptococci levels and dental caries Keyes scores showed different degrees of reduced the hmme-pdt display of pit and fissure caries and smooth surface caries has better control effect (P＜0.05), but lower than that of the sodium fluoride group; hmme-pdt + sodium fluoride group has no obvious synergistic inhibitory effect on caries. Conclusion HMME-PDT can effectively inhibit oral Streptococcus mutans reproduction and reduction in the caries incidence. Key words: caries; HMME-PDT; animal model; Streptococcus mutans; fluoride

R781

A

1008-6455（2016）10-0002-04

新疆医科大学第一附属医院院内科研项目资助（自然科学基金青年项目）(2013ZRQN31)

赵今,女,口腔医学博士,主任医师,教授,研究方向:牙体牙髓病病因及防治；E-mail：nql200702@sina.com

2016-05-25

2016-09-19