马 振，杨 红，何 云，卢景宁，彭金波，吴玉泉

（1.广西中医药大学第一附属医院超声科，广西 南宁 530023；2.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021）

肝细胞性肝癌超声造影定量分析与P53表达相关性研究

马 振1，杨 红2，何 云2，卢景宁2，彭金波2，吴玉泉2

（1.广西中医药大学第一附属医院超声科，广西 南宁 530023；2.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021）

目的：探讨肝细胞性肝癌（HCC）中突变型P53蛋白表达与超声造影定量分析参数的相关性。方法：回顾性分析57 例HCC患者超声造影定量分析的各项参数，取得肿瘤组织并用免疫组化染色的方法测定P53蛋白的表达，分析它与造影定量分析参数的相关性。结果：①P53的阳性表达率为54.3%（31/57）。②在P53阳性表达组和阴性表达组中峰值强度、平均渡越时间、达峰时间之间无显著差异（P＞0.05），而上升斜率、流出时间之间有显著差异（P＜0.05）。③P53的阳性表达与峰值强度、平均渡越时间、达峰时间无明显相关性（P＞0.05）；P53的阳性表达与上升斜率呈正相关，r=0.377（P＜0.05），与流出时间呈负相关， r=-0.410（P＜0.05）。结论：HCC超声造影参数的上升斜率、流出时间与突变型P53蛋白的表达之间存在一定的相关性，通过时间-强度曲线，可以无创性的评估P53的表达。

肝肿瘤；癌，肝细胞；基因，p53；超声检查，多普勒，彩色

肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的肝脏恶性肿瘤[1]。肝癌发病率位居全国肿瘤发病率的第2位，每年我国死于肝癌的人数约占全球总人数的45%[2]。突变型P53基因在HCC的形成过程中发挥着重要作用，通过多条信号转导通路调控HCC的发生发展，与肿瘤的侵袭、转移密切相关[3]。本研究应用超声造影（Contrast-enhanced ultrasound，CEUS）定量分析参数与P53基因表达的相关性进行分析，对相关超声造影定量参数进行筛选，拟通过无创的超声造影定量分析的方法评估P53基因的表达，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2012年1月—2014年12月在广西医科大学第一附属医院行CEUS检查的57例HCC患者。其中男37例，女20例，年龄21～75岁，平均（45.6±13.7）岁，单发病灶43例，多发病灶14例，多发病灶选取其中最大的一个病灶进行观察。病灶最大直径1.5～11.4 cm，平均（4.2±1.5）cm，病灶经手术或肝穿刺活检病理证实。

1.2 仪器与方法

1.2.1 CEUS检查

使用GE-LOGE9超声诊断仪，凸阵探头，频率1～5MHz。机械指数0.17～0.19，超声造影剂使用SonoVue（Bracco公司），使用前瓶内注入生理盐水5mL，振荡直到冻干粉完全分散。先常规进行二维超声检查，确认目标病灶后先对病灶的大小、内部回声、边界、与周围组织的关系进行观察，然后固定探头位置不移动，切换至低机械指数造影模式，嘱患者平静呼吸，通过置于肘前静脉的留置针快速推注1.5mL微泡混悬液。推注造影剂的同时启动超声仪上的计时器，观察造影过程120 s并以DICOM格式存储动态图像。

1.2.2 分析软件

使用TomTec公司开发的SonoLiver CAP软件对造影动态影像资料进行定量分析，生成时间-强度曲线（Time-intensity curve，TIC），获取能动态反应血流灌注的各项参数。

1.2.3 SonoLiver CAP软件定量分析方法

在造影图像上描画三个感兴趣区域（Regions of interest，ROI）：①肝脏切面ROI（蓝色边框），此为病灶所在区域的肝脏切面；②病灶ROI（绿色边框），此区域为被分析病灶，ROI描画轮廓不小于病灶的50%；③参考ROI（黄色边框），选取在病灶周围与病灶同等深度及大小的肝实质，避开大血管及囊性或坏死区域（图1）。运用SonoLiver CAP软件自带的呼吸补偿校正功能，尽量减少因呼吸或者探头移动对数据或图像产生的影响。

本研究中获得的参数包括：峰值强度（Maximum intensity，IMAX）：最高灌注强度时病灶ROI与参考ROI的百分比；达峰时间（Time to peak，TTP）：造影剂从开始计时到达峰值强度的时间；平均渡越时间（Mean transit time，mTT）：从开始时间至TIC下降至最高强度值一半的时间；上升斜率（Rising slope，RS）：IMAX/TTP；流出时间（Washout time，WT）：从最高峰值强度到病灶ROI曲线与参考ROI曲线相交点的时间（图2）。

图1a HCC常规二维超声图。 图1b HCC ROI示意图：肝脏切面ROI（蓝色边框）；病灶区域ROI（绿色边框）；参考区域ROI（黄色边框）。 图2 时间-强度曲线各参数示意图。Figure 1a. Two dimensional ultrasonogram of HCC. Figure 1b. ROI illustration map:ROI(blue frame)on liver section,the lesion area ROI(green border)and the reference area ROI(yellow border).Figure 2.Time intensity curve diagram with all parameters.

1.3 病理学方法

1.3.1 样本采集

所有病例均在超声造影后1周内行手术切除肿瘤或者穿刺活检，术后标本及时送病理检查，甲醛固定后，选取肿瘤周边组织标本，常规脱水后石蜡包埋。蜡块连续切片张，每张厚4μm，作免疫组化。

1.3.2 检测试剂

P53免疫组化的染色采用标准免疫组化S-P法，鼠抗人P53单克隆抗体购自福州迈新生物技术公司，即用型免疫组织化学超敏Ultrasensitive S-P试剂盒采用福州迈新生物技术有限公司的产品。空白对照PBS以代替一抗。

1.3.3 检测方法

由一名具有15年以上临床经验的病理学专家在不知道病理诊断结果的情况下，分析P53的表达水平。P53阳性计数以细胞核染色呈棕黄色为标准。高倍镜（×400）下随机计数5个视野，每个视野200个细胞，当阳性细胞比例≥10%记录为P53表达阳性，＜10%记录为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计描述和分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两计量资料间比较采用t检验。两种非正态分布指标的相关性分析采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有病例均顺利完成超声造影检查和定量分析及P53表达检测。

病理分析结果：P53阳性表达组31例（54.3%），阴性表达组26例（45.6%）。

P53阳性组和阴性组CEUS参数的差异：在P53阳性组和阴性组中，IMAX、TTP、mTT在两组间无统计学差异。而RS、WT均有统计学差异（P＜0.05）（表1，图3～5）。P53阳性组RS较阴性组大，说明阳性组造影剂流入速度较快；P53阳性组WT较阴性组短，说明阳性组流出时间较短，病灶很快变为低增强。

表1 P53表达与超声造影定参数的关系

图3 P53不同表达时造影参数的差异。Figure 3. Differences in imaging parameters with different P53 expression.

图4 P53阳性表达CEUS定量分析参数。图4a：免疫组织化学P53染色阳性病理图；图4b：P53阳性表达HCC二维超声图像；图4c：P53阳性表达HCC造影和ROI区域；图4d：P53阳性表达HCC造影定量分析TIC。Figure 4. CEUS quantitative parameters in positive expression of P53.Figure 4a:Immunohistochemical staining with positive P53 expression.Figure 4b: HCC two-dimensional ultrasonogram with positive P53 expression.Figure 4c:HCC CEUS and ROI setting with positive expression of P53.Figure 4d:Quantitative analysis of TIC with positive expression of P53.

图5 P53阴性表达CEUS定量分析参数。图5a：免疫组织化学P53染色阴性病理图；图5b：P53阴性表达HCC二维超声图像；图5c：P53阴性表达HCC造影和ROI区域；图5d：P53阴性表达HCC造影定量分析TIC。Figure 5. CEUS quantitative parameters in negative expression of P53.Figure 5a:Immunohistochemical staining with negative P53 expression.Figure 5b:HCC two-dimensional ultrasonogram with negative P53 expression.Figure 5c:HCC CEUS and ROI setting with negative expression of P53.Figure 5d:Quantitative analysis of TIC with negative expression of P53.

2.3 P53阳性表达与造影参数相关性分析

经过相关分析发现P53的阳性表达与IMAX、mTT、TTP无明显相关性 （P＞0.05），P53的阳性表达与RS呈正相关，相关系数0.377（P＜0.05）（见表2），说明随着P53阳性表达率的增加上升斜率增快，造影剂流入的速度增快。P53阳性表达与WT呈负相关，相关系数-0.410（P＜0.05），说明P53阳性表达率越高造影剂流出时间越短，消退越快。

表2 P53阳性表达与超声造影参数相关性分析

3 讨论

突变型P53基因的表达与多种恶性肿瘤的发生、发展、浸润、转移密切相关[4]，它能通过激活蛋白激酶C诱导血管内皮生长因子（Vascular endothelial cell growth factor，VEGF）的表达，从而促进血管的生成[5]。肿瘤血管的生成在肿瘤的发展和演变过程中起着重要作用，HCC是富血供的肿瘤，癌细胞的快速生长及转移都有赖于滋养血管不断生长提供养分[6]。超声造影剂是一种微米级的纯血池造影剂，能够反映肿瘤内微血管的分布和血流动力学情况，随着超声造影定量分析技术的发展，目前已能够利用定量软件获得造影的相关参数,精确反映肿瘤病灶内微血管的灌注情况以及增强模式，从而对肿瘤进行诊断和评估。

刘广健等[7]对121个HCC病灶的研究表明，肿瘤分化程度越差，造影增强消退时间也越短。我们的研究发现，P53阳性组和阴性组中RS、WT均有统计学差异。RS代表造影剂流入后到达峰值强度的速率，WT表示造影剂从峰值强度流出变为等增强的时间。P53阳性表达的造影模式呈现快进快出的模式，流入的速率较快，并且很快流出变为低增强。这是因为突变型P53基因通过多种机制影响肿瘤组织的生长，导致肿瘤的恶性程度增加，通过促进肿瘤血管的生成，肿瘤微血管密度增高，动静脉瘘增多，门静脉血供减少，肝动脉供血增多[8]，循环呈高动力状态，使得造影剂流入和流出增快，所以RS增高、WT缩短。而P53阴性表达组以门静脉血供为主，肿瘤组织血窦较丰富，造影剂微泡廓清缓慢，因此造影剂流入速率较慢，流出时间较长。

李振洲等[9]对37例乳腺癌患者的研究发现P53阳性组的峰值强度及曲线下面积增大，造影剂通过时间延长，与阴性组有显著差异（P＜0.05）。认为乳腺癌超声造影参数与P53表达之间有相关性。Pei等[10]对130例HCC患者的研究表明，WT在不同分化程度HCC组中有显著性差异。认为WT能够提示肿瘤的分化程度。我们通过对HCC超声造影定量参数进行统计学相关性分析，发现其中的参数RS、WT与突变型P53的表达具有一定的相关性。随着P53表达的增加，WT缩短，RS增高。拉孜等[11]研究发现，血清P53抗体表达率在低分化的HCC中明显高于中高分化的HCC，血清P53抗体阳性率与肿瘤病理分化程度呈负相关。表明血清P53抗体的过表达是HCC细胞低分化、高转移的生物学潜能标志。突变型P53会影响肿瘤的分化和血管的生成，导致肿瘤恶性程度增高，瘤内血管结构紊乱、密度增高、管径增大，动静脉瘘增多，这会导致造影剂流入速度增快，流出时间变短。因此HCC超声造影参数WT、RS能够反映P53的表达情况，可以无创性的评估P53基因的表达，有利于评估疗效和估计预后。

本研究的局限性在于样本的例数还比较少，病人来源仅仅局限于HCC，没有包含其他类型的肝癌。同时超声造影定量分析的感兴趣区域和对照区域的选取不可避免的带有一定的主观性。在未来的研究中，应该提供更大的样本和更多类型的肿瘤研究。

以往我们了解P53基因的表达只能通过手术或穿刺活检等有创的手段获得，而随着超声造影定量分析技术的发展，通过对HCC超声造影定量分析参数上升斜率和流出时间的测定，可以无创和可重复评估肿瘤P53基因的表达，进而了解HCC的组织分化程度及预后，并且可以对抗肿瘤血管治疗和基因治疗的疗效进行评估，对临床治疗HCC具有重要意义。

[1]Jemal A,Center MM,Ward E,et al.Cancer occurrence[J].Cancer Epidemiol,2009,471(1):3-29.

[2]Shariff MI,Jane C,Gomaa AI,et al.Hepatocellular carcinoma: current trends in worldwide epidemiology,risk factors,diagnosis and therapeutics[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2014,4(4): 19-37.

[3]Gartd AL,Radhakfishnan SK.Lost in transcription:p2l repression mechanisms,and consequences[J].Cancer Res,2005,65(10): 3980-3985.

[4]Toegel S,Hoffmann O,Wadsak W.Uptake of bone-seekers issolely associated with mineralization A study with99mTc-MDP,153Sm EDTMP and18F-fluoride on osteoblasts[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2006,33(4):491-494.

[5]Patard JJ,Rioux-Leclercq N,Masson D,et al.Absence of VHL gene alteration and high VEGF expression are associated with tumour aggressiveness and poor survival of renal-cell carcinoma[J]. Br J Cancer,2009,101(8):1417-1424.

[6]Burns PN,Wilson SR.Focal Liver Masses:Enhancement Patterns on Contrast-enhanced Images—Concordance of US Scans with CT Scans and MR Images[J].Radiology,2007,242(1):162-174.

[7]刘广健，吕明德，谢晓燕，等.肝细胞性肝癌超声造影表现与肿瘤病理分化关系的研究 [J].中国超声医学杂志，2006，22（3）：209-212.

[8]霍英杰，袁静，杨景震，等.3.0T MRI在肝癌随访中检出新发微小癌灶的影像研究 [J].中国临床医学影像杂志，2014，25（2）：98-102.

[9]李振洲，罗长锐，方凡，等.乳腺癌超声造影定性及定量分析与p53表达的相关性研究[J].中国临床医学影像杂志，2012，23（7）：465-467.

[10]Pei XQ,Liu LZ,Liu M,et al.Contrast-enhanced ultrasonography of hepatocellular carcinoma:correlation between quantitative parameters and histological grading[J].Br J Radiol,2012,85 (1017):740-747.

[11]拉孜，官泳松，次白.血清P53抗体与原发性肝癌病理分化程度的相关性研究[J].西部医学，2011，23（1）：93-95.

A correlation study of CEUS quantitative analysis and the expression of P53 in hepatocellular carcinoma

MA Zhen1,YANG Hong2,HE Yun2,LU Jing-ning2,PENG Jin-bo2,WU Yu-quan2
(1.Department of Medical Ultrasonics,the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530023,China;2.The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

Objective:To investigate the expression of mutant P53 protein and their correlation with contrast-enhanced ultrasound quantitative parameters in hepatocellular carcinoma(HCC).Methods:Fifty-seven cases of HCC were enrolled.A retrospective analysis of the contrast-enhanced ultrasound quantitative parameters was performed,and then their correlation with P53 protein by immunohistochemistry staining method was done.Results:①P53 positive expression rate was 54.3%(31/57).②In P53 positive and negative groups,the peak strength,the mean transit time and time to peak showed no significant difference(P＞0.05).There was significant difference in the rising slope and washout time(P＜0.05).③There was no correlation between the expression of P53 and maximum intensity,mean transit time or time to peak(P＞0.05).The positive expression of P53 was positively correlated with the rising slope with r=0.377(P＜0.05),and negatively correlated with washout time with r=-0.410(P＜0.05).Conclusion:For HCC contrast-enhanced ultrasound parameters,there is a certain correlation between rising slope,washout time and mutant P53 protein expression.The time-intensity curve might noninvasively assess the expression of P53.

Liver neoplasms;Carcinoma,hepatocellular;Genes,p53;Ultrasonography,Doppler,color

R735.7；R445.1

A

1008－1062（2016）01－0025－04

2015-04-26

马振（1983－），男，山东菏泽人，主治医师。E-mail：mg9.8@163.com

杨红，广西医科大学第一附属医院超声科，530021。E-mail：yanghonggx@163.com

国家自然科学基金（81260222）；广西自然科学基金（2012GXNSFAA276041）；广西卫生厅重点科研项目（桂卫重2011089）。