孙晓玲

(哈励逊国际医院病理科，河北 衡水 053800)



非甾体抗炎药对脑缺血再灌注时大脑脑组织钙调神经磷酸酶与环氧化酶表达的影响

孙晓玲

(哈励逊国际医院病理科，河北 衡水 053800)

目的 观察大鼠脑缺血/再灌注损伤(CI/RI)24 h和72 h脑组织钙调神经磷酸酶(CaN)、环氧化酶(COX)-1和COX-2的分布及非甾体抗炎药阿司匹林和罗非昔布的影响。方法 雄性SD大鼠，线栓法制作右侧局部大脑中动脉缺血2 h、再灌注24 h或72 h模型。分为假手术组、溶媒组、阿司匹林(50 mg/kg)组和罗非昔布2 mg/kg组。TTC染色法观察脑损伤面积；免疫组化法测定CaN 、COX-1和COX-2表达，高倍视野(×400)计数阳性细胞表达数目。结果 ①与CI/RI 24 h相比，CI/RI 72 h脑损伤面积减小，阿司匹林和罗非昔布均有明显的保护作用。②CaN表达：CI/RI 24 h和72 h，CaN表达减少；阿司匹林明显提高两个时间点的表达，而罗非昔布没有明显效果。③COX-1表达：CI/RI 24 h和72 h，COX-1表达没有明显变化，阿司匹林和罗非昔布对其没有明显影响。④COX-2表达：CI/RI 24 h和72 h，COX-2表达明显增强，阿司匹林和罗非昔布明显降低其表达，2组间无显著差异。结论 脑缺血/再灌注时CaN 、COX-1和COX-2在脑组织的阳性表达无明显一致性；CaN可能是阿司匹林神经保护作用的新靶点。

脑缺血/再灌注；钙调神经磷酸酶；环氧化酶；阿司匹林；罗非昔布

脑缺血/再灌注损伤(CI/RI)是一个多环节复杂的病理过程，其损伤机制尚不十分清楚。阿司匹林和罗非昔布作为非甾体类抗炎药，对CI/RI的脑保护作用及机制已有报道〔1～4〕。有研究发现，阿司匹林对CI/RI时钙调神经磷酸酶(CaN)活性有明显影响，其影响途径和机制尚不清楚〔5，6〕。环氧化酶(COX)-1和COX-2作为非甾体类抗炎药物常见的作用靶点，阿司匹林对CaN活性的影响是否与COX有关，尚未见报道。本文观察大鼠CI/RI 24 h和72 h脑组织CaN、COX-1和COX-2的分布及非甾体抗炎药对其的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 阿司匹林粉，Sigma 公司产品，以无水乙醇助溶(乙醇终浓度<0.5%)；罗非昔布由江南大学医学院邱丽颖教授惠赠；氯化三苯基四氮唑(TTC)，上海化学试剂公司，磷酸盐缓冲液配制，避光低温贮存。CaN、COX-1和COX-2一抗购自武汉博士德生物有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 模型制备及分组 雄性SD大鼠，体重(250±10)g，上海斯莱克实验动物中心提供，合格证号：SCXK(沪)2003-0003。术前12 h禁食，自由饮水。直径0.205 mm、长2.5 cm尼龙线作栓子，75%乙醇浸泡15 min，生理盐水冲洗后置于1%肝素等渗盐水中备用。8%水合氯醛400 mg/kg麻醉，参考邱丽颖等〔5〕腔内线栓法制作右侧大脑中动脉栓塞模型。按Longa 5分制评分标准，术后评1～3分者为手术成功标志。假手术组除不插入栓子，其余相同。缺血2 h麻醉状态下拔出线栓行再灌24 h或72 h。随机分成假手术组，溶媒组、阿司匹林组(50 mg/kg)和罗非昔布组(2 mg/kg)。再灌注同时灌胃给予溶媒或药物一次。

1.3 脑损伤面积测定 再灌注24 h或72 h时迅速断头取脑，去除小脑和脑干，于冠状位四刀五分切法切片，切片厚度约2 mm。将切片速置于2%TTC染液中，37℃避光孵育30 min，正常组织呈红色，损伤组织呈白色。孵育后的脑片置于10%甲醛溶液中避光保存，7 d内数码相机拍照输入计算机，AutoCAD软件计算5个脑片10个平面的损伤面积和损伤侧总面积，以损伤面积占该侧大脑总面积的百分比作为损伤范围的统计参数。

1.4 脑组织免疫组织化学实验 再灌注24 h或72 h时迅速断头取脑，取视交叉至漏斗柄的脑片，置10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，5 μm冠状切片置于多聚赖氨酸处理的玻片，脱蜡至水。免疫组化SABC法测定CaN、COX-1和COX-2基因蛋白，严格按试剂盒说明进行。胞质呈棕色颗粒的细胞为阳性表达细胞。每张切片在损伤区和内周边区各取5个高倍视野(10×40)，计数CaN、COX-1和COX-2阳性细胞数，最后取10个视野的平均数。

1.5 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件进行方差分析，q检验。

2 结 果

2.1 阿司匹林和罗非昔布对不同时间点CI/RI大鼠脑损伤面积的影响 脑缺血/再灌注24 h时，溶媒组脑损伤面积为(25.32±2.21)%，与假手术组(0)比较有显著差异(P<0.01)；再灌注72 h时脑损伤面积为(10.53±1.86)%，与24 h比较有显著差异(P<0.01)。脑缺血/再灌注24 h，阿司匹林和罗非昔布组损伤面积分别为(0.94±0.08)%和(0.85±0.03)%，脑缺血/再灌注72 h，Asp和Rof损伤面积分别为(0.66±0.04)%和(0.71±0.05)%，都明显缩小了损伤面积，与溶媒组相比均有显著差异(P<0.01)。

2.2 阿司匹林和罗非昔布对不同时间点CI/RI大鼠脑组织CaN表达的影响 脑缺血/再灌注24 h时，溶媒组CaN表达与假手术组比较显著降低(P<0.01)；再灌注72 h与24 h比较无统计学差异。阿司匹林可明显改善两个时间点CaN的表达(P<0.01)。罗非昔布对两个时间点的CaN的表达没有明显影响。见表1。

表1 阿司匹林和罗非昔布对不同时间点CI/RI大鼠脑组织CaN表达的影响

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与溶媒组比较：3)P<0.01

2.3 阿司匹林和罗非昔布对不同时间点CI/RI大鼠脑组织COX-1表达的影响 脑缺血/再灌注24 h时，溶媒组COX-1表达与假手术组比较无显著差异(P>0.05)；再灌注72 h与24 h相比无统计学差异(P>0.05)。阿司匹林和罗非昔布对两个时间点COX-1的表达均没有明显影响(P>0.05)。见表2。

表2 阿司匹林和罗非昔布对不同时间点CI/RI大鼠脑组织COX-1表达的影响

2.4 阿司匹林和罗非昔布对不同时间点CI/RI大鼠脑组织COX-2表达的影响 脑缺血/再灌注24 h时，溶媒组COX-2表达与假手术组相比显著增加(P<0.01)；再灌注72 h与24 h相比没有统计学差异(P>0.05)。阿司匹林和罗非昔布可明显改善两个时间点COX-2的表达，两组药物组间没有明显差异(P>0.05)。见表3。

表3 阿司匹林和罗非昔布对不同时间点CI/RI大鼠脑组织COX-2表达的影响

与假手术组比较：1)P<0.01；与溶媒组比较：2)P<0.01

3 讨 论

CI/RI的机制尚不十分清楚，目前认为与脑能量代谢、兴奋性氨基酸、细胞因子、黏附分子的表达等多种因素有关〔7〕。脑组织CaN 是目前发现体内受Ca2+/CaM激活的唯一蛋白磷酸酶，其在脑缺血中的作用和重要地位也早已引起重视。阎力君等〔8〕报道，小鼠断头5 min后，胞质CaN内源性底物的磷酸化水平明显降低，CaN 参与了缺血后脑内蛋白磷酸化过程的调控。与Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的作用失衡有关〔9〕。研究证实，蛋白质的磷酸化和去磷酸化反应的失衡是迟发性神经元死亡的主要原因，缺血后CaN独特的时间依从性变化可能是其中的关键因素〔10〕。国内有报道，缺血后急剧发生的神经细胞内磷酸化和去磷酸化的过程的严重失衡也可能是急性期神经元损伤的主要原因之一，并认为CaN含量的下降可以作为神经细胞不可逆损伤的标志〔11〕。COX-2参与了CI/RI。CaN和COX之间是否在CI/RI过程中存在相互关系尚未见报道。本研究表明阿司匹林对CaN的作用与抑制COX-2关系不密切。CaN可能是阿司匹林作用的新靶点。

1 Qiu LY，Du B，Li Y，etal.Anti-apoptotic effects of aspirin following cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Neural Regen Res,2008；3(9)：979-84.

2 Qiu LY，Li Y，Yang ZY，etal.Changes in neuronal apoptosis and apoptosis modulatory factors in cerebral ischemia/reperfusion〔J〕.Neural Regen Res，2007；2(6)：344-9.

3 Qiu LY，Du B，Li Y，etal.The change of brain metabolism and the action of aspirin after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Physiol Acta，2012；64(s1)：206.

4 余 涓，邱丽颖，周 宇，等.脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达与罗非昔布的影响〔J〕.中国药理学通报，2005；21(5)：572-5.

5 邱丽颖，杨志勇，杜 斌，等.脑缺血再灌注损伤大鼠重要脏器钙调神经磷酸酶活性变化及阿司匹林的干预作用〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(5)：640-2.

6 邱丽颖，余 涓，陈崇宏.阿司匹林抗脑缺血/再灌注损伤的作用及机制〔J〕.中国药理学通报，2006；22(8)：972-5.

7 Baliga SS，Jaques-Robinson KM，Hadzimichalis NM，etal.Acetaminophen reduces mitochondrial dysfunction during early cerebral postischemic reperfusion in rats〔J〕.Brain Res，2010；1319(1)：142-5.

8 阎力君，魏 群.大鼠突触体钙调神经磷酸酶内源底物的研究〔J〕.生物化学与生物物理学报，1997；29(5)：513-5.

9 Nagahiro S，Uno M，Sato K，etal.Pathophysiology and treatment of cerebral ischemia〔J〕.J Med Invest，1998；45(1-4)：57-70.

10 Aronowski J，Grotta JC，Strong R，etal.Interplay between the gamma ishamform of PKC and calcineurin in regulation of vulnerability to focal cerebral ischemia〔J〕.J Cere Blood Flow Metab，2000；20(2)：343-9.

11 汤 颖，苏志强，赵 艳，等.大鼠局灶脑缺血后钙调神经磷酸酶活性和含量变化〔J〕.中风与神经疾病杂志，2003；20(1)：4446.

〔2015-03-19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

孙晓玲(1983-)，女，硕士，主要从事病理诊断研究。

R74

A

1005-9202(2016)20-4969-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.012