刘晋津，刘 群，吴 腾，郝志明

（1．天津市南开医院，天津 300100；2．天津市西青区畜牧水产发展服务中心，天津 300380；3．天津农学院，天津 300384）

甘油浓度、去甲肾上腺素对猪精液冷冻保存的研究

刘晋津1，刘 群2，吴 腾1，郝志明3

（1．天津市南开医院，天津 300100；2．天津市西青区畜牧水产发展服务中心，天津 300380；3．天津农学院，天津 300384）

该试验在前人研究的基础上，就甘油浓度和去甲肾上腺素对猪精液的冷冻保存做了进一步探究。结果表明：4%甘油浓度冻后精子活率最佳，为0．483 ±0．698。而添加去甲肾上腺素并不能明显提高猪冻后精子活率，15 µL组效果略好。

猪；甘油浓度；去甲肾上腺素；精液；冷冻

猪作为人们主要的家畜之一，有其独特的畜产品价值。随着饲养条件的改善以及繁殖学的发展，鲜精的配种不利于长途运输，因此猪精液的冷冻保存也被越来越多的人关注。但是由于猪冻精繁殖率较低使其冻精在全球人工授精的比例不足一个百分点［1］。综上，研究猪精液的冷冻保存就有着现实意义。

Polge于1956年首次对猪精液冷冻并获得成功［2］。但是与牛羊相比，猪的精液冷冻难度相对较大［3］。影响猪精液的冷冻保存有诸多因素，Abeydeear［4］在20世纪90年代对稀释液进行过研究，胡传活等人研究发现，稀释液中加入20%的卵黄，精子活率最好［5］。在过去几十年的研究中，冷冻保护剂的出现使猪精液的冷冻保存大步发展，殷方芝等［6］人发现，没有一种保护剂比甘油效果更为出色，一般甘油浓度多为2%～3%。宋春青［7］研究发现去甲肾上腺素可以提高犬精液低温保存的活率。在实际生产中，大都也是让公畜爬跨几次来增加去甲肾上腺素的分泌。本试验在前人努力研究的基础上，对甘油浓度和稀释液中加入去甲肾上腺素进行研究，探讨更有利于猪精液冷冻保存的方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物

长白猪8头，雄性，性成熟，精液品质良好。

1.2 稀释液配置

双蒸水中加入Tris-葡萄糖-柠檬酸-青霉素-链霉素，配置成基础稀释液，后用等体积80%的基础液加入20%的卵黄配置成I液，再将I液分别加入体积分数分别为2%，3%，4%的甘油配置成II液（对照组）。

1.3 精液稀释处理

新鲜采集的精液经过处理后检查精子的活性和密度，在室温下静置2 h。调试离心机，以1 000 r/min离心5 min，去除上清液，缓慢加入等温的I液后封口，放入盛有等温水的烧杯中，将烧杯放入4 ℃冰箱降温平衡。

将已降温至4 ℃的精液分别加入等温的含有不同比例甘油的II液后继续在4 ℃冰箱平衡4 h。

1.4 精液冷冻和解冻

在4 ℃状态下，将已经平衡好的精液分装在0．25 mm的细管内，封口后将细管插入已经预冷到-70 ℃的细管插座内，在液氮面上3 cm处熏蒸10 min后立即放入液氮罐内。

从液氮罐中快速取出精液细管，在38 ℃水浴中解冻30 s，在400倍镜下观测精子活率。

2 试验结果与分析

试验数据按单因子试验进行分析，各组间进行显著性检验。

2.1 甘油浓度对冻后精子活性的影响

表1结果表明，甘油浓度为4%冻后精子活率为0．483 ±0．698，显著高于甘油浓度为2%和3%的精子活率（P＜0．05），而后两者之间并没有显著差异（P＞0．05)。

图1 显微镜下观察精子活率

图2 猪精

2.2 去甲肾上腺素对冻后精子活率的影响

从表1试验结果表明，4%甘油浓度的精子活率最好，所以本组试验采用的甘油浓度为4%。在4%甘油浓度的II液中分别加入体积分数为5 μL，10 μL，15 μL的去甲肾上腺素配置成试验组用液。

从表2试验结果表明，虽然加入15 μL去甲肾上腺素的试验组精子活率最好，但是去甲肾上腺素不同含量的3组与对照组比较都没有明显差异（P＞0．05)。可见3个不同剂量的去甲肾上腺素并不能对冻后精子的活率产生影响。

表1 甘油浓度对冻后精子活性的影响

表2 去甲肾上腺素对冻后精子活率影响

3 讨论

甘油又名丙三醇，其分子结构中3个羟基为亲水基团，可以和精液中的水结合，限制或者干扰水分子的晶格排列，产生冰晶。而其烃链为疏水基团，可阻止精子内水分相互渗透，从而产生保护作用。甘油是动物精子冻存最为常用的保护剂，而甘油的浓度在不同牲畜冻精研究中用量也不同，例如牛的冻精中适宜甘油浓度为6%左右［8］。Fahy［9］对甘油浓度进行比较，发现2%体积分数的甘油冷冻效果最佳，5%最差，高浓度的甘油反而会造成精子的损伤［10］，这与我国研究人员殷方芝的研究结果相类似。我们在试验中又对2%～4%的甘油浓度进行比较，发现就猪的冻精活率而言，4%效果最好，为0．483 ±0．698。

去甲肾上腺素是由交感神经分泌的一种神经递质，同时也是一种激素。当公畜射精时，交感神经兴奋，去甲肾上腺素分泌增加，从而可以提高射精量和精液的品质，即精子活率升高。试验研究表明，去甲肾上腺素可以明显延长猪精子低温保存的存活时间，本试验对去甲肾上腺素对冷冻精子活率进行研究，就3个剂量而言，效果并不明显，15 μL的剂量组效果略微突出，也可能再加大一些去甲肾上腺素的剂量，会有显著差别，这一点有待继续研究。那么，为什么去甲肾上腺素可以明显延长猪精液低温保存时间而对冷冻保存效果不明显呢？其中原因我们还并不十分清楚，也可能去甲肾上腺素在低温保存过程中降低了精子本身的耗能，但是由于冷冻温度过低，使这种保护作用消失。

［1］ 禚艳书，王坚，刘铁铮．猪精液冷冻保存研究进展［J］．江苏农业科学，2006（3）：136-140．

［2］ POLGE C．Artificial insemination in pigs［J］．Vet Pec，1956（68）：62-76．

［3］ 李青旺，江中良，王立强，等．猪精液冷冻保存的初步研究［J］．西北农林科技大学学报（自然科学版），2003，31（4）：63-66．

［4］ ABEYDEEAR L R，DAY B N．Fertilization and subsequent development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified Tris-buffered medium with frozenthawed ejaculated spermatozoa［J］．Biol Reprod，1997（57）：729-734．

［5］ 胡传活，孙艳艳，胡传水，等．稀释液中卵黄浓度对猪精液冷冻保存效果的影响［J］．广西农业科学，2010，41（6）：609-611．

［6］ 殷方芝，戴建军，张德福．猪精液大剂型冷冻保存的研究进展［J］．国外畜牧学：猪与禽，2008（1）：66-68．

［7］ 宋春青，郝志明，刘洪柱，等．去甲肾上腺素和睾酮对低温保存犬精子的影响［J］．畜牧兽医科技信息，2009（4）：46-48．

［8］ 李青旺，武浩．动物繁殖学［M］．西安：西安地图出版社，2000．

［9］ FAHY G M．Effect of rapid warming of boar semen on sperm morphology and physiology［J］．Cryobiology，1986（23）：1-13．

［10］ 姜兴刚，赵桂英，和绍禹，等．冷冻前离心方法、平衡时间、甘油浓度对猪精子冷冻保存的影响［J］．黑龙江畜牧兽医，2008（6）：42-43．

2016-02-18)