郭明宇，彭诗博，陈元操，常晓栋，张　茜，陈　萌

（1.承德医学院临床医学系本科2014级，河北承德 067000；2.承德医学院影像本科2014级；3.指导教师）

学生园地

Cystatin C对脑缺血再灌注损伤大鼠LC3的影响*

郭明宇1，彭诗博2，陈元操1，常晓栋1，张茜1，陈萌3

（1.承德医学院临床医学系本科2014级，河北承德 067000；2.承德医学院影像本科2014级；3.指导教师）

脑缺血；再灌注损伤；自噬；LC3

中风是引起人类死亡和致残的主要原因之一，其中缺血性中风即脑梗死，主要由脑血管闭塞引起。而所有脑血管中，若大脑中动脉闭塞常会导致脑血流量大幅度减少，从而造成谷氨酸兴奋、氧化应激和炎症反应等一系列神经中毒的事件，最终导致神经细胞死亡，如细胞凋亡、坏死和自噬［1-3］。自噬不仅参与神经细胞死亡的过程，还有研究发现自噬可以起到神经保护的作用［4］。本研究应用Cystatin C干预脑缺血再灌注损伤大鼠，观察自噬相关蛋白LC3的变化，研究Cys C对缺血再灌注损伤大鼠自噬的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物 成年雄性清洁级Spague-Dawley大鼠24只，体质量260-280g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2药物与试剂 Cystatin C（Enzo life Sciences，瑞士）；一抗LC3试剂（MBL株式会社医学生物学研究所，日本），β-actin（中杉金桥，北京）；二抗分别为辣根酶标记羊抗兔IgG（KPL 美国），辣根酶标记羊抗小鼠（中杉金桥，北京）。

1.3动物模型制备 术前禁食12h，模型组和Cys C组参照Zea-Longa改良线栓法［5］制备右侧大脑中动脉闭塞2h再灌注24h模型。假手术组仅分离颈总、颈内、颈外动脉，不做插线处理。大鼠苏醒后模型成功标志为：右眼出现Horner征、行走时向左侧转圈，提尾时左前肢屈曲内收。

1.4神经功能缺损评分 参照Longa评分标准，于再灌注24h对各组大鼠进行评分。无神经功能缺损症状0分；不能完全伸展对侧前爪1分；向外侧转圈2分；向内侧倾倒3分；不能自发行走，意识丧失4分。1-3分留用，0 分、4分者弃去，并及时补足。

1.5方法 实验大鼠适应性饲养1周，随机分为假手术组、模型组、Cys C组，每组8只。Cys C组于术前60min鼠尾静脉注射Cys C（5mg/L），假手术组和模型组注射等量生理盐水。

麻醉后将各组大鼠迅速处死，采用Western Blot法检测损伤脑皮质组织中LC3蛋白表达。模型组和Cys C组取缺血再灌注损伤侧脑皮质组织，假手术组取同侧对应部位新鲜脑皮质组织，3组均加入裂解液后提取总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。总蛋白上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜，含5%脱脂奶粉的TBS缓冲液室温封闭，分别加入一抗兔抗LC3（1：1000）、小鼠抗β-actin（1：500），4℃孵育过夜。洗膜后分别加入二抗（HRP）结合的羊抗兔（1：5000）和羊抗小鼠（1：2000）孵育；洗膜，超敏发光液（ECL）显色剂发光，胶片曝光显影。Quantity One 4.62软件分析条带的平均灰度值，以目的条带与对应β-actin条带灰度值之比作为LC3蛋白表达量的相对水平。

1.6统计分析 用SPSS 17.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1神经功能缺损评分 假手术组无神经功能缺损症状，模型组神经功能缺损评分为2.43±0.51；Cys C组神经功能缺损评分1.80±0.52，较模型组评分明显降低（P＜0.05）。

2.2脑组织大体标本观察 假手术组无明显变化，模型组脑组织大体标本可见右侧脑组织出现明显水肿，体积增大；与模型组相比，Cys C组脑组织水肿有所改善。

2.3Western Blot结果 假手术组脑组织LC3蛋白表达为0.609±0.077，模型组损伤侧脑组织LC3蛋白表达水平为0.811±0.035，较假手术组有所增高；而Cys C组LC3表达1.01±0.378，较模型组和假手术组明显升高（P＜0.05）。见附图：

附图　各组大鼠脑组织中LC3蛋白的表达水平

3　讨论

缺血性脑血管病在治疗过程中容易发生缺血再灌注损伤，损伤后细胞程序性死亡会出现细胞凋亡及自噬等细胞死亡形式。自噬是通过自身形成的自噬囊泡，吞噬胞浆内变性蛋白质和细胞器，通过微管相关蛋白，以动力依赖性的方式转运至溶酶体降解的过程［6］。它有别于坏死，也不同于凋亡。适度激活自噬可能在受损细胞中帮助清除受损的细胞器和异常蛋白、防止蛋白聚集，对细胞损伤起保护作用［7］。

LC3系统主要参与自噬泡的修饰，LC3蛋白的表达水平是自噬检测的敏感指标［8］。正常情况下LC3-Ⅰ主要存在于胞浆中，在自噬发生过程中，微管相关蛋白LC3-Ⅰ与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合，形成LC3-II，参与自噬体的形成。LC3-II是自噬体的标志分子，其含量多少与自噬泡数量的多少成正比。因此，通过检测LC3-II可反映自噬活性［9］。

Cystatin C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，具有刺激细胞生长的功能，与中枢神经系统有非常重要的关系。Cys C具有抗淀粉样蛋白生成作用，有研究表明迟发性阿尔茨海默病（AD）与Cys C的基因连锁相关。Tizon［11］等［10］研究表明神经元在营养匮乏、秋水仙素、氧化应激等细胞毒性环境中Cystatin C对其具有保护作用。这种保护作用不是Cys C抑制组织蛋白酶B实现，而是Cys C通过mTOR途径诱导功能性自噬实现的；如果抑制自噬，Cys C的神经保护作用就会被阻止。有学者研究发现，Cystatin C可作为一种新的自噬诱导剂，通过诱导大鼠蛛网膜下腔出血后脑皮层的自噬可能对早期脑损伤起到保护作用［12］。此外，外源性的Cys C能够保护神经元避免β淀粉样蛋白（Aβ）毒性诱导的死亡［13］。因此通过调节Cys C的表达有望成为治疗中风、AD和其它神经退行性疾病的关键。

本实验结果显示：x与假手术组相比，模型组LC3蛋白表达增多，Cystatin C干预脑缺血再灌注损伤大鼠后，脑皮质中LC3表达持续增高，自噬作用增强。但对于Cystatin C在缺血再灌注损伤中是否具有神经保护作用尚不清楚，其在自噬与缺血再灌注损伤中的确切机制和涉及的调控因子，还需更多的实验研究来阐明。

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（学生园地栏目编辑：张 健）

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A

1004-6879（2016）01-079-02

2015-10-10）

* 河北省自然科学基金项目（H2015406046）