李驰荣　黄惠　龚盛昭　陈庆生　李丽　董银卯

机体在代谢过程中不断产生活性氧自由基，也不断地被消除，使机体维持有利无害、低水平、稳定平衡的生理性自由基含量。但过量自由基可造成机体细胞非特异性氧化损伤，而引发各种疾病。如心脑血管疾病、癌症、艾滋病、糖尿病、早老性痴呆、震颤麻痹症等几乎都与氧自由基代谢有关。二苯代苦味酰自由基（1，1-diphenyl-2-piciylhydrazyl free radical，DPPH）分光光度法是近些年发展起来的一种筛选抗氧化剂的简便方法，其原理是利用DPPH溶液在517nm处的特征吸收峰，当有自由基清除剂存在时，自由基清除剂与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐减弱甚至消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，样品的抗氧化活性可以通过清除DPPH的量来评价，因而可用分光光度法进行定性定量分析。该方法有简便、灵敏、直接等特点。本文采用DPPH法测定18种中药提取物不同浓度下的抗氧化活性，利用Folin-Ciocalteu法测定这些中药提取物中的总多酚含量，及采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定总黄酮含量。结果表明：各中药的抗氧化活性不同，其中不同浓度的地榆、地榆炭、虎杖的抗氧化活性最好，总酚酸及总黄酮含量相对较高。本文筛选结果对中药提取物在美白化妆品配方中的应用提供科学依据。

材料与方法

1.材料与试剂

药材：牡丹皮、玉竹、炒白术、地榆炭、生白术、乌梅、地榆、甘草、川芎、金樱子、苍术、当归、葛根、桑葚、白蔹、红花、桑叶、虎杖中药均购自于北京同仁堂药店。

2.主要试剂与仪器

没食子酸.Al（NO3）3，国药集团化学试剂有限公司；芦丁，百灵威科技；盐酸，北京北化精细化学品有限责任公司：甲醇、NANO2、NaOH、碳酸钠，西陇化工股份有限公司；Folin-Ciocalteu试剂，北京索莱宝科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）试剂、维生素C（Vc）、乙醇，北京化工厂，上述试剂均为分析纯。

CQ-250超声波清洗器，上海超声波仪器厂：酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司，DZKW-S-4）；TB-2002电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司：KQ-400KDB超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司：SIGMA 4K15离心机，北京博劢行仪器有限公司；GX-04粉碎机，上海高翔食品机械厂；移液枪（1mL/5mL.Eppendorf，20055793/R34489B）；旋涡混合器（MX-F，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司）

实验方法

1.提取物制备方法

把18种植物粉碎后，各取4g，然后用95%乙醇80mL，室温浸泡1h，超声提取20min，用滤膜进行过滤，得各植物的提取液。

2.DPPH清除率实验

实验参考s nchez-Vioque等的方法并在此基础上进行修改。通过测定不同样品对DPPH自由基的清除能力以考查其抗氧化活性。

DPPH乙醇溶液的配制：准确称取20mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，得质量浓度为0.08g/L的DPPH无水乙醇溶液，0～4℃下避光保存，现配现用。

VC水溶液的配制：准确称取25mgVC，加入去离子水溶解并定容于250mL容量瓶中，配制为质量浓度为100ug/mL的VC水溶液。

1.0mL样品溶液（或VC水溶液）与1.0mL40ug/mL的DPPH·溶液混合，室温下黑暗中放置10min后，于517nm处测吸光度。DPPH·清除率的计算公式如下：

DPPH·清除率（%）=[1-（A1A2）/A0】*100%

式中，A0为未加提取物溶液的DPPH·吸光度值；A1为加提取物溶液的DPPH·吸光度值；A2为提取物溶液吸光度值。

3.18种样品提取液总酚酸、总黄酮含量的测定

总酚酸含量的测定采用Folin Ciocalteu法。对照品溶液：称取0.1g没食子酸，用蒸馏水溶解、定容至100mL，此溶液质量浓度为1.0g/L。分别吸取上述溶液0.0，2.0，4.0.6.0，8.0，10mL至10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，所得没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g/L。将甲醇与体积分数为0.3%的盐酸按体积之比6：4混匀，分别取不同浓度的没食子酸对照品100uL于试管中，依次加入100uL甲醇-盐酸混合液，2mL质量分数为2%的碳酸钠水溶液，混匀。静止2min后加入体积分数为50%的Folin-Ciocalteu试剂100uL，暗处理30min，分别测定在750nm下的吸光度。以吸光度值A为纵坐标，相应没食子酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为：y=0.6203x+0 1241，r=0.9994（y值为吸光度，x值为加样质量浓度）。

供试品溶液：取上述不同样品提取液，按照上述步骤操作，在750nm波长下测定吸光度。

总黄酮含量的测定采用硝酸铝亚硝酸钠比色法。精密称取芦丁对照品0.1g，用体积分数为75%的甲醇溶解、定容至100mL容量瓶，此溶液质量浓度为1.0g/L。精密吸取0.0，2.0，4.0，6.0.8.0.10.0mL于10mL容量瓶，用体积分数为75%的甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.0，0.2.0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL的对照品溶液。分别取1mL不同浓度的芦丁样品于10mL容量瓶中，依次加入4mL去离子水、0.3mL质量分数为5%的NaNO2水溶液，5min后加入0.3mL质量分数为10%的Al（NO3）3水溶液，反应1min后依次加入2mL质量分数为1%的NaOH水溶液，2.4mL去离子水，510nm下测定吸光度。以吸光度值A为纵坐标，相应芦丁质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程为：y=0.3908x-0.026，r=0.9941（y值为吸光度，x值为加样质量浓度）。

供试品溶液：取上述不同样品提取液，按照上述步骤操作，在510nm波长下测定吸光度。

结果与讨论：

各种天然提取物对DPPH自由基的清除能力如表1所示，实验结果表明，18种中药的95%乙醇提取物中，不同浓度的地榆、地榆炭、虎杖的抗氧化活性最好，牡丹皮、甘草、川芎、金樱子、白蔹具有较好的抗氧化活性，其他中药的乙醇提取物，在测定浓度下（0.5%，1.0%，2.0%），没有表现出显著的抗氧化活性。

总酚酸及总黄酮含量如表2所示，从测定结果中可以看出其总酚酸总黄酮含量：地榆>虎杖>地榆炭，抗氧化活性测定结果与总酚酸及总黄酮含量有一定相关性。

结论：

人体中的自由基与许多疾病的生成与发展有密切联系，受控的自由基对人体是有益的，但当人体中的自由基超过定的量，便会失去控制，给我们的生命带来伤害，因此不断去发现具有抗氧化活性的天然植物是非常必要而有意义的。自由基还是引起皮肤衰老的重要原因，自由基在黑色素的形成、结构和反应中起着重要作用，所以具有抗氧化活性的植物中药可以在美白与抗衰老化妆品中有广泛应用。通过对18种植物抗氧化活性与成分的分析可以看出：地榆、地榆炭、虎杖具有很强的自由基清除能力，牡丹皮、甘草、川芎、金樱子、白蔹也具比较强的自由基清除能力。同时，地榆、地榆炭、虎杖的总酚酸与总黄酮的含量也较高。