和东阳，牛延菲，徐 怡，秦 波，游 燕

(云南省药物研究所，云南白药集团创新研发中心，云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111)



高效液相色谱法测定三七药材中硝酸盐含量

和东阳，牛延菲，徐 怡，秦 波，游 燕

(云南省药物研究所，云南白药集团创新研发中心，云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111)

高效液相色谱；三七药材；硝酸盐；含量测定

众所周知，日摄入硝酸盐含量超过正常负荷时，将会危害人体健康[1]，但硝酸盐广泛存在于自然环境中，为植物天然成分之一[1]。硝酸盐在人体内还原成亚硝酸盐后，如果累积量过多，可导致高铁血红蛋白症，还可与人体内的胺类物质发生反应，形成强力致癌物质，诱发消化系统癌变[2-3]。目前常用酚二磺酸法、镉柱还原分光光度法、紫外分光光度法、离子色谱等方法来测定硝酸盐含量。本文采用高效液相色谱法，选择四丁基溴化铵作为离子对试剂，利用四丁基溴化铵与硝酸根阴离子形成中性缔合物，在乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾-磷酸溶液为流动相中，被非极性键合柱(ODS)分离并定量测定。

1 仪器、试剂和药材

1.1 仪 器

E2695高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)，美国Waters；AG285型电子天平，瑞典METTLER TOLEDO公司；Milli-Q Advantage A10制水机，XMTD-4000 电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2 试剂和药材

硝酸盐对照品溶液(BW3058，1000 mg/L)，中国计量科学研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯(默克)、硼酸钠(AR)，天津市化学试剂三厂；磷酸二氢钾(AR)，国药集团化学试剂科技有限公司；磷酸(AR)，天津市科密欧化学试剂有限公司；四丁基溴化铵(AR)，国药集团化学试剂三厂；水为超纯水，美国Milli-Q公司。

三七药材，均由文山三七花公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Utimate pheny1-ether(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈：0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液+0.03 mmol/L四丁基溴化铵+磷酸(称取6.8045 g磷酸二氢钾溶于1000 mL水中，加入0.944 g四丁基溴化铵，再用磷酸调pH=3.2)=10:90；流速1.0 mL/min；检测波长：216 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密吸取硝酸盐对照品溶液(中国计量科学研究院，BW3058，1000 mg/L)1.0 mL于10 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，在逐级稀释至C=0.005 mg/mL，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取三七粗粉5.0 g加入5.0 mL超纯水于100 mL烧杯中，用玻璃棒搅拌制成匀浆，再往烧杯中加入12.5 mL硼砂饱和液搅拌均匀，以70 ℃左右的水约150 mL将试样转入250 mL容量瓶中，于沸水浴中加热20 min，取出后冷却至室温，然后加超纯水至刻度，摇匀，静置片刻。再经0.45 μm滤膜滤过取滤液，待测。

2.2.3 空白溶液的制备

直接往250 mL容量瓶中加入70 ℃左右的超纯水约150 mL再加入12.5 mL硼砂饱和液摇匀，于沸水浴中加热20 min，取出后冷却至室温，然后加超纯水至刻度，摇匀，静置片刻。再经0.45 μm滤膜滤过取滤液，待测。

2.3 系统适用性试验

按“2.2”项下供试品溶液的制备方法制备对照品溶液、供试品溶液、供试品溶液+对照品溶液和空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定记录色谱图，结果见图1。由图1可知供试品溶液色谱与对照品溶液色谱在相同的位置上有相同的色谱峰出现，而空白溶液无此峰出现，表明三七药材的其他成分对硝酸盐成分的含量测定无干扰。另取硝酸盐对照品适量加入供试品溶液中，摇匀，照上述色谱条件进行测定，所得色谱图中，硝酸盐峰面积明显增大，其它色谱峰面积变化不大，比较对应色谱峰的吸收光谱，具一致性，说明该色谱峰为硝酸盐的信号。

图1 系统适用性

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液配制并逐级稀释配制成一系列浓度的对照品溶液(见表1)，分别进样10 μL，测定峰面积，以对照品的进样量(mg)为横坐标，峰面积为纵坐标计算得回归方程见为y=14637841.30x+84017 (r=0.9999)，对照品含量5～500 μg范围峰面积呈良好的线性关系。

表1 线性关系测定结果

2.5 检测限及定量限

取上述储备液用超纯水稀释配制成一系列浓度的对照品溶液，分别进样，以信噪比3倍和10倍作为指标，考察硝酸盐含量的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表2。

表2 硝酸盐含量的检测限和定量限

2.6 精密度试验

取配制好的硝酸盐对照品溶液(0.005 mg/mL)，按“2.1”项下色谱条件连续进样6针，进样量10 μL。结果，以峰面积计算，峰面积平均值为832706.7，RSD=1.3%(n=6)，结果表明本法仪器精密度较为良好。

2.7 样品重复性

精密称取同一批次三七药材(批号：20150426)6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，进样量10 μL。结果，三七药材中硝酸盐的平均含量为187.6 μg/g(RSD=1.5%)，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

取同一份三七药材(批号：20150426)供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，进样量10 μL，分别于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，结果，平均峰面积为885362.3，RSD=1.4%(n=7)，表明供试品溶液中硝酸盐在24 h内较稳定。

2.9 加样回收试验

精密称取同一批次已知含量供试品9份(已测硝酸盐平均含量为187.6 μg/g，每份约2.5 g，对照品硝酸盐碱浓度0.1 mg/mL)，然后按“2.2”项下供试品溶液制备方法同法处理，将处理好的供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，进样量10 μL，进行测定。计算平均回收率为100.2%，RSD=1.6% (n=9)。结果见表3。

表3 加样回收率测定结果

2.10 样品测定

表4 样品测定结果

取6个不同批次三七药材，按“2.2”供试品溶液制备法制备供试品，按“2.1”项色谱条件进样，进样量10 μL，进行测定。结果见表4。

3 讨 论

本法应用反相高效液相色谱-二极管阵列检测器法测定三七中硝酸盐的含量，不需要经过镉柱还原，具有快速、准确、灵敏、简便等优点，三七中其它成分对其检测均不形成干扰。此外，色谱条件的选择上，笔者曾比较了甲醇-水、 甲醇-乙腈-水为流动相，虽分离度都能达到要求，但在同一色谱柱上甲醇-乙腈-水柱压较低，保留时间适当，峰形更好。对已具备了高效液相色谱仪的实验室，本方法扩展了仪器的检测范围，并且大大提高工作效率，值得推广使用，同时本法也适用于其他药材及产品的硝酸盐含量测定。

[1] 杨华梅.反相高效液相色谱法测定蔬菜鲜样中硝酸盐[J].现代预防医学，2008, 35(3):543-544.

[2] 蔡志斌,张英,刘丽.高效液相色谱快速测定乳粉中硝酸盐和亚硝酸盐[J].中国卫生检验杂志，2009(3):584-585.

[3] 张秋菊,崔世勇,姜丽华,等.反相高效液相色谱法同时测定酱腌菜中亚硝酸盐和硝酸盐[J].中国卫生检验杂志,，2008,18(7):1304-1305.

[4] 国家药典委员会.中国药典.一部[S].北京：中国医药科技出版社,2015:11-12.

[5] 鞠颖,廖辉.三七活血化瘀作用析要[J].河南中医，2013(4):592-594.

[6] 欧小宏,张智慧,郑冬梅,等.氮肥运筹对二年生三七产量、品质及养分吸收与分配的影响[J].中国现代中药,2014,16(12):1000-1005.

Determination of Nitrate Content in Panax Notoginseng by HPLC

HEDong-yang,NIUYan-fei,XUYi,QINBo,YOUYan

(Yunnan Institute of Materia Medica, Yunnan Baoyao Group Innovation and R&D Center, Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation, Yunnan Kunming 650111, China)

The determination of the nitrate content in Panax notoginseng by HPLC was discussed. The separation was performed with tetrabutyl ammonium (TBABr) dissolved in acetonitrile-0.05 mol/L monopotassium phosphate (KH2PO4) (10:90) buffer as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min and accomplished with utimate phenyl-ether(150 mm×4.6 mm，5 μm) column at 30 ℃. The detection wavelength was 216 nm and the injection volume was 10 μL. Under the detection conditions, the nitrate content in Panax notoginseng showed good linearity(r=0.9998). The recovery rate was 100.2%(n=9), RSD=1.6%(n=9). This method is simple, rapid, accurate, reliable and reproducible. It is suitable for detecting various contents of nitrate in Panax notoginseng.

high performance liquid chromatography; Panax notoginseng; nitrate; content determination

和东阳(1987-)，男，硕士，助理工程师，主要从事中药质量标准制订。

游燕(1976-)，女，高级工程师，主要从事中药质量标准制订。

R927.2

A

1001-9677(2016)020-0090-03