杂交兰组培苗与内生真菌共生培养体系的构建1)

2016-11-19张晋彦吴争宁惠娟方载浩梁立军崔永一

东北林业大学学报 2016年10期

关键词：兰科菌根菌剂

张晋彦吴争宁惠娟方载浩梁立军崔永一

(浙江农林大学，临安，311300) (龙井市农村经济管理服务中心) (浙江农林大学)

杂交兰组培苗与内生真菌共生培养体系的构建1)

张晋彦吴争宁惠娟方载浩梁立军崔永一

(浙江农林大学，临安，311300) (龙井市农村经济管理服务中心) (浙江农林大学)

为了筛选出对杂交兰组培苗生长有益的菌株，采用4种内生真菌(被孢霉属Mortierellasp.)，通过固体菌剂和液体菌剂2种接种方式，建立杂交兰组培苗与真菌的共生培养体系。共生培养150 d后，运用石蜡切片法观察到菌丝、菌丝结等典型的菌根结构。结合重分离真菌形态观察和分子鉴定，确定重分离菌株均为原接种菌株。结果表明：液体菌剂接种方式相比固体菌剂，对杂交兰组培苗生长的促进作用显著；菌株FC5和FC9液体菌剂对杂交兰组培苗的生长促进作用显著；FC17液体菌剂对杂交兰组培苗根部生长促进效果显著。

内生真菌；杂交兰；菌剂；菌根显微结构；分子鉴定

To screen out beneficial fungi strains toCymbidiumhybridum(C.hybridum‘Princess Nobuko’×C.goeringii‘Huangshuixian’) plantlets growth, using solid inoculation and liquid inoculation, we established mycorrhizal symbiosis system between four kinds of endophytic fungi (Mortierellasp.) andCymbidiumhybridumplantlets. After 150-day symbiotic culture, typical mycorrhizal structures such as hyphae and pelotons were founded by permanent paraffin-cut section method. Considering morphological observation and molecular identification, it was confirmed that fungi isolated fromC.hybridumplantlets roots were the same as origin fungi. The liquid inoculum treatment was better than solid inoculum treatment. Strains FC5 and FC9 liquid inoculum treatments had obvious promoting effect on the growth ofC.hybridumplantlets. Strain FC17 liquid inoculum treatments significantly promoted the growth ofC.hybridumplantlet roots.

兰科植物(Orchidacea)主产热带及亚热带地区[1]，具有较高的观赏、药用价值，其种类丰富，自古以来深受人们喜爱。随着市场需求量的日益增长，野生兰科植物资源遭到破坏，数量急剧减少，这使人们逐渐意识到保护兰科植物种质资源的重要性[2]。目前，组织培养技术在兰科植物快速繁育及工厂化生产中被广泛地运用，解决了部分野生珍稀品种的繁育问题。但是，组培苗驯化成活率偏低，植株瘦弱，开花延迟，这些现象成为了目前制约兰花产业发展的主要瓶颈[3]。

兰科植物是典型的菌根共生型植物，菌根共生关系被认为是引发其多样性和适应性进化的一个主要因素[4]。Sakamoto et al[5]研究表明兰科植物内生真菌种类与其所处地理位置具有较大的相关性。在兰科植物的生命周期中，不同的生长发育阶段所需的真菌种类不同[6]。同一种真菌也可能与多种兰科植物形成共生关系[7-8]。真菌通过菌丝体侵入兰科植物根内，形成菌丝团。植物细胞通过消解、吸收菌丝团来获得养分[9]。在兰科植物的生长初期，植物通过吸收真菌提供的水分和营养物质，提高幼苗成活率，并促进其生长发育[10-12]。

本研究利用课题组从野生国兰根部分离保存的4种内生真菌，开展杂交兰组培苗与内生真菌的共生体系研究，探讨真菌对杂交兰组培苗生长的影响，筛选对其生长有益的菌株，为兰花生物肥的研发及其优良种苗高效培育提供科学依据。

1 材料与方法

供试植株：浙江农林大学组织培养实验室提供的杂交兰组培苗，其亲本为大花蕙兰‘皇后’(Cymbidiumhybridum‘Princess Nobuko’)(♀)和春兰‘黄水仙’(Cymbidiumgoeringii‘Huangshuixian’)(♂)，选取长势一致且植株健壮的杂交兰组培苗，株高5～6 cm，叶3～5片，根3～5条，移栽驯化于浙江农林大学平山温室。

供试菌株：课题组保存的4种真菌[13]，菌株编号为FC5、FC9、FC12和FC17。

1.1 培养基及基质

PDA液体培养基：去皮马铃薯煮30 min后，取其滤液加入蔗糖20 g·L-1，于121 ℃灭菌20 min备用，pH值自然。

PDA固体培养基：取马铃薯滤液加入蔗糖20 g·L-1，琼脂7.5 g·L-1，于121 ℃灭菌20 min备用，pH值自然。

固体基质：将木屑、棉籽壳、麦麸按体积比64%∶26%∶10%混合均匀，加入适量蒸馏水，湿度以手握基质，指缝中有水渗出但不滴下为准。混合均匀后分装于无菌瓶中，121 ℃高压灭菌20 min[14]。

兰苗驯化基质：将松树皮基质按中号与小号1∶1体积比(中号松树皮直径约12 mm，小号松树皮直径约6 mm)混合均匀，浸泡在稀释1 000倍的多菌灵溶液中过夜，次日清水投洗2～3次，自然风干，备用。

1.2 液体菌剂配制

在供试菌株菌落边缘打取一个菌饼，接种到PDA液体培养基中，于摇床转速120 r/min，温度26 ℃下暗培养5～7 d[15]。

1.3 固体菌剂配制

用无菌量筒量取悬浮均匀的菌液，均匀倒入固体基质中，在温度26 ℃暗培养7～10 d，观察到菌丝长满瓶壁后备用。

1.4 真菌重分离法

从每个处理中随机抽取5株植株，取其新生营养根从根尖向上5～7 cm的小段，每株2～3段，在流水下冲洗20～30 min，用已消毒的剪刀剪成1 cm小段。用75%酒精消毒1 min，无菌水冲洗1次，再用0.1%升汞消毒6 min，无菌水冲洗3～4次。滤纸吸干根段表面水分，切去根段两头组织至5 mm左右小段，接种于PDA培养基上(一次性培养皿规格90 mm×15 mm，每板接种4个根段)，于恒温培养箱中26 ℃暗培养3～5 d后，观察重分离情况[16]。有白色絮状菌丝分离出后，使用接种针挑取菌落边缘菌丝接种于新PDA培养基上，转接3次纯化后移入冰箱保存。

1.5 真菌微观形态观察

在超净工作台中，用接种针挑取菌落边缘少量菌丝于载玻片上，用乳酸酚棉兰染料染色，盖上盖玻片制成临时玻片，于OLYMPUS生物显微镜400倍下观察真菌形态(菌丝有无隔膜，有无分枝，有无孢子，孢子形态，孢子大小等)并拍照记录。

1.6 菌根显微结构观察

从各处理中随机抽取5株植株，每株取3段3～4 cm的营养根根段，流水洗净后切成5 mm小段，经FAA固定，系列脱水，石蜡包埋，使用手动旋转切片机切片，切片厚度为14～16 μm，使用番红固绿染色，中性树胶封片，用光学显微镜观察，并照相记录[17-18]。

1.7 真菌分子鉴定

用CTAB法提取真菌基因组DNA，PCR扩增后使用DNA胶回收试剂盒(Sangon,China)回收纯化，胶回收产物连接入pEASY-T1载体(TransGen,China)，转化大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆摇取菌液，测序工作委托Sangon公司完成。

1.8 试验设计

本试验选取长势一致且植株健壮的杂交兰组培苗，分组编号并称取鲜质量，种植于直径90 mm塑料盆内。每盆种植1株，每处理20盆，共设9个处理(表1)，每处理3次重复。试验共2个因子，分别为菌株种类(菌株FC5，菌株FC9，菌株FC12，FC17)和接菌方式(A固体菌剂处理：在实验室无菌条件下，将真菌菌液10 mL均匀接种在已配好的固体基质内，待其长满瓶壁后，取培养好的固体菌剂，以10 g/盆的用量分别接种于处理组杂交兰组培苗根部。B液体菌剂处理：在温室环境下，将不同真菌菌液以10 mL/盆的用量，浇施在处理组杂交兰组培苗根部)。对照组每盆基质中混入10 g固体基质，加蒸馏水10 mL，于温室条件(温度15～28 ℃，湿度60%～70%，晴天遮光60%～80%，保持通风，施肥遵循少量多施的原则，奥绿肥(Scotts,America)每盆10粒；花宝2号(Hyponex,America)稀释1 000倍，一周浇灌一次)共生培养150 d。

表1 杂交兰组培苗接种内生真菌(被孢霉属Mortierellasp.)试验设计

编号菌株编号来源植株处理方式栽培数量/盆1FC5蕙兰1(Cymbidiumfaberi)1固体菌剂602FC5蕙兰1(Cymbidiumfaberi)1液体菌剂603FC9蕙兰2(Cymbidiumfaberi)2固体菌剂604FC9蕙兰2(Cymbidiumfaberi)2液体菌剂605FC12春兰(Cymbidiumgoeringii)固体菌剂606FC12春兰(Cymbidiumgoeringii)液体菌剂607FC17四季兰(Cymbidiumensifoliumvar.rubrigem-mum)固体菌剂608FC17四季兰(Cymbidiumensifoliumvar.rubrigem-mum)液体菌剂609对照组 ——60

1.9 数据处理

共生培养150 d后，从每个处理组和对照组组培苗中随机选择10株生长健壮的植株，对单株鲜质量、株高、叶片数量、根长、根数量进行统计，分别在试验处理开始和结束时记录，并计算各项指标的相对生长量，使用spss19.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 内生真菌重分离

对处理组和对照组新生营养根根段进行真菌重分离。处理组根段样本均分离得到白色绒毛状的真菌(图1)，对照组根段样本未分离出真菌。

2.2 重分离真菌形态观察

分离得到的4种真菌经纯化后，真菌宏观形态表现为白色絮状菌丝，向周围均匀辐射生长，7～10 d左右长满9 cm培养皿；生长面有丰富菌丝，菌株FC12菌落形成半径不同的同心圆环(表2)。

A～H为接种菌株FC5、FC9、FC12、FC17固体菌剂和液体菌剂处理组组培苗根段分离真菌情况。

菌株编号正面形态反面形态直径/mm一致性FC5白色,蓬松绒毡状,中间隆起白色,平滑49.25±0.34一致FC9白色,毛毡状白色,平滑44.25±0.49一致FC12乳白色,菌丝丰富,蓬松,辐射状浅黄色35.50±0.88一致FC17白色,蓬松绒毡状白色37.75±0.19一致

注：直径为接入PDA培养基上生长6 d后的菌落直径的平均值±标准误；一致性为重分离真菌菌株和课题组保存原真菌菌株的形态一致性分析。

在光学显微镜下观察真菌的微观形态发现菌丝有隔，有分枝，孢子圆形，孢子直径在6.06～7.57 μm(表3)。

表3 重分离真菌的微观形态

注：一致性为重分离真菌菌株和课题组保存原真菌菌株的微观形态一致性分析；表中数据为平均值±标准误。

2.3 杂交兰组培苗菌根结构观察

杂交兰组培苗根段横切面从外到内分别是根被，皮层和中柱。在其新生营养根中，菌丝穿透根被组织，侵入皮层细胞，形成菌丝、菌丝结等典型菌根结构。菌丝的分布比较分散，由外向内逐渐减少(图2A)。在靠近外皮层的皮层细胞中有时可观察到针状结晶(图2B)。在靠近外皮层的皮层细胞中观察到质粒，分布集中(图2C)。接菌组培苗根部皮层细胞中，可以观察到生长旺盛的真菌菌丝，经番红固绿双重染色后呈现绿色，也可以观察到老化的菌丝，经染色后呈红色(图2D)。

2.4 重分离内生真菌rDNA ITS序列分析

重分离获得的真菌菌株用CTAB法提取基因组DNA，以DNA为模板，真菌通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)作为上下游引物，进行PCR扩增。扩增产物经1.0%琼脂糖电泳分析，检测到扩增片段。

对真菌rDNA ITS扩增目标位点进行回收、克隆、测序，结果表明本试验的4个真菌菌株序列长度均在600 bp左右。通过BLAST比对，4个真菌rDNA ITS序列与GenBank中已登录的被孢霉属Mortierellasp. dd08032真菌序列显示较高的序列相似性见表4。结合真菌形态学观察，可以判定接种真菌菌株侵入杂交兰组培苗根部。

2.5 共生培养对杂交兰组培苗生长的影响

在杂交兰组培苗与内生真菌共生培养初期，处理组与对照组生长速度无显著差异，随着共生培养时间的增长，差异逐渐显现。处理组叶片普遍比对照组叶片坚挺、翠绿，并且新叶增长速度快。接种固体菌剂处理组少部分新生根存在发黑萎蔫的现象，而液体菌剂处理组幼苗新根呈乳白色，数量较多且生长健壮。

A.皮层细胞内菌丝结(P为菌丝结)；B.皮层细胞内针状结晶(AC为针状结晶)；C.皮层细胞内的质粒(PL为质粒)；D.老化菌丝(F为真菌菌丝)。

图2 杂交兰组培苗菌根结构观察

表4 重分离真菌rDNA序列与最相近序列种Mortierellasp. dd08032(FJ810149.1)比对结果

来源植物菌株编号覆盖范围/%最大识别率/%序列长度/bp蕙兰1FC5-110099616FC5-2100100617FC5-3100100617蕙兰2FC9-110099617FC9-210099617FC9-310099617春兰FC12-1100100617FC12-2100100617四季兰FC17-1100100617FC17-2100100617FC17-310099617

接种真菌后发现内生真菌对杂交兰组培苗鲜质量、株高、新叶数等地上部分的生长促进作用显著。菌株FC5、FC9液体菌剂处理组鲜质量的增加量显著高于对照组，增长率分别达325.9%和322.7%。FC9液体菌剂株高的增长量达到60 mm左右，与对照组的差异达极显著水平。FC9固体菌剂处理和FC5液体菌剂处理组株高增长量与对照组的差异达到显著水平。FC9、FC17固体菌剂处理和FC5液体菌剂处理组新叶数均极显著高于对照组，FC9固体菌剂处理组新叶数达到5片(图3)。

在促进根系生长方面，菌株FC17液体菌剂处理能较好地促进根系的生长，新根数和根长增长量均极显著高于对照组。FC5液体菌剂处理对新根的产生也有明显的促进作用。FC9固体菌剂处理组新根数与对照组的差异达极显著水平，新根数约6条(表5)。

3 结论与讨论

兰科植物与真菌的共生关系被认为是一种偏利性共生，即共生体系建立后，兰科植物受益更大，体现在生物量的明显增加[19]。陈晓梅对接菌金钗石斛研究发现菌株MF15对金钗石斛长势有影响，能极显著增加气生根数量，对无菌苗生长有促进作用[20]。张丽春发现接种小菇属真菌铁皮石斛根系粗大，生长速度加快，生物量显著提高[21]。本试验FC17液体菌剂仅对杂交兰根系生长有较大的促进作用。从野生蕙兰中分离出的两种菌株FC5和FC9，其液体菌剂对杂交兰组培苗具有明显的促进作用，具有商业开发与应用前景，值得深入研究。

两种接种方式均可以使杂交兰和内生真菌建立共生关系，但二者共生关系达到平衡才能促进植株的生长发育。通过观察发现接种固体菌剂处理组基质间隙始终有少量菌丝分布，而接种液体菌剂处理组，前期基质内有少量菌丝分布，随着共生时间增长，基质内菌丝分布量减少，后期基质内未能观察到明显的菌丝。液体菌剂接种方式优于固体菌剂，可能是随着接种时间的增加，固体菌剂处理组真菌菌丝浓度增大，使杂交兰组培苗和真菌的共生关系失衡，抑制了植株的生长[22]。固体菌剂最佳的基质配方、菌液接种剂量，以及适宜真菌的生长环境和培养时间等问题还有待研究。生长快速又易与植株达成共生关系的真菌，在施用中应使用较低浓度，或者减少接种剂量[23]。

图3 不同处理组对杂交兰组培苗的影响

编号鲜质量/g叶片数量/片株高/mm根数量/条根长/mm1(3.58±0.50)*3.21±0.3730.67±2.79(4.33±0.48)*25.91±3.42 2(7.78±0.67)*(4.54±0.33)**(47.33±2.78)*(5.17±0.56)**30.08±2.0135.86±0.51(5.04±0.87)**(48.17±0.83)*(6.33±0.48)**26.74±3.004(7.86±0.47)*(4.38±0.40)*(60.67±2.59)**3.50±0.6828.41±2.5056.83±0.59(4.04±0.31)*(42.33±2.11)*(4.33±0.40)*30.91±1.6366.07±0.623.04±0.40(43.17±2.39)*2.50±0.5833.41±2.507(3.45±0.60)*(4.54±0.33)**34.83±4.362.17±0.21(15.08±1.62)**85.68±0.953.21±0.26(45.67±3.57)*(5.00±0.56)**(37.58±2.65)**95.52±0.912.71±0.5033.17±2.712.83±0.5626.74±1.54

注：*和** 分别表示与对照组CK在P<0.05水平上差异显著，在P<0.01水平上差异极显著；表中数据为共生处理前后试验植株生物量增长量平均值±标准误。

兰科菌剂作为一种微生物肥料，有环保，可持续，生产成本较低等特点，可避免化学肥料、农药残留对人畜健康构成的威胁及对环境破坏，同时可以用作生物防治，防治病虫害，且害虫和病菌难以产生抗药性。通过对兰科植物内生真菌研究，筛选出有益兰科植物共生菌，对解决濒危兰花资源重引入或迁地保护等问题具有重要的实践意义，对兰科植物的工厂化生产和兰花生物肥的研发具有广阔的市场前景。

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Establishing Symbiotic Cultivation System of Tissue-culturedCymbidiumhybridumPlantlets and Endophytic Fungi//

Zhang Jinyan, Wu Zheng, Ning Huijuan

(Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, P. R. China);

Fang Zaihao

(Service Center for the Rural Economy Management, Longjing);