周新桥，陈达刚，李丽君，刘传光，李巨昌，陈友订

（1广东省农业科学院水稻研究所，广州510640；2广东省水稻育种新技术重点实验室，广州510640）

水稻秧苗期耐冷种质资源筛选

周新桥1，2，陈达刚1，2，李丽君1，刘传光1，2，李巨昌1，陈友订1，2

（1广东省农业科学院水稻研究所，广州510640；2广东省水稻育种新技术重点实验室，广州510640）

为了发掘水稻尤其是籼稻耐冷基因资源，促进水稻耐冷育种，以‘丽江新团黑谷’为耐冷对照，以‘桂99’为冷敏感对照，从“广东省水稻种质资源库”以及南方稻区收集的150份材料中初步筛选出18份作为本试验的供试材料，采取人工气候箱低温胁迫法（PGV-36，日均温8.5℃），进行水稻苗期耐冷种质资源筛选研究。结果显示：①秧苗期日均8.5℃的人工气候箱低温胁迫会导致水稻秧苗生长发育明显减缓受阻，随着时间的推进，供试材料的生长发育停止。②经人工气候箱低温胁迫后，不论是处理3天还是6天，各供试材料幼苗死亡率差异达到极显著水平；总体上粳稻的耐冷性强于籼稻。③以低温胁迫3天和6天后各供试材料自然气候条件下恢复生长10天的幼苗死亡率为指标评价鉴定其耐冷能力，‘粳44’耐冷性强，8.5℃人工低温胁迫6天后死亡率在25%以下；其次是‘苗110’、‘2-319’和‘华占’；‘源宝占’、‘苗108’耐冷能力中等，‘318’、‘R2168’和‘创丰1号’等12份材料耐冷性弱；耐冷性强的种质中‘华占’、‘2-319’为籼稻，‘苗110’为籼粳交后代，可应用于籼稻耐冷育种。

水稻；耐冷；种质；筛选；苗期

0　引言

水稻是仅次于小麦的世界第二大粮食作物，全世界水稻播种面积约为1.5亿hm2，其中10%以上稻作面积受到低温冷害威胁［1］。水稻历来是中国的第一大农作物，中国约2/3的人口以稻米为主食，水稻生产对中国的粮食安全举足轻重。水稻低温冷害，通常指水稻遭遇生育最低临界温度以下的低温影响，从而导致水稻不能正常生长发育而减产。近年来极端气候频现，因冷害而造成的水稻减产损失愈演愈烈，粮食安全十分严峻。因此，解决水稻冷害问题对于世界粮食安全、促进水稻产区的经济发展具有十分重要的现实意义。

有关水稻冷害，国内外学者进行了大量研究。不仅从直观的形态上明确了水稻对冷害的响应［2-3］，有关低温胁迫会导致水稻膜损伤，从而导致细胞超微结构发生明显变化；低温不仅能破坏非酶防御系统，还能破坏酶防御系统等的生理研究报道很多［4-7］。水稻耐冷基因定位研究如火如荼地进行，并取得了可喜的成绩［8-10］。随着生物技术的发展，如今水稻耐冷研究已经深入到转录组学以及代谢组学水平［11-12］。有关耐低温胁迫鉴定方法、评价标准以及预防措施研究也不少［2］。然而，解决水稻冷害最有效、最环保、最经济的途径是培育和种植耐冷新品种，而耐冷品种选育的首要关键是耐冷种质的挖掘与利用。虽然水稻耐冷基因报道不少，但是水稻耐冷能力是个数量性状，受多基因控制，转移单个基因往往只能获得部分抗性甚至基因沉默，达不到耐冷育种的目标，而且转基因水稻还存在生物安全性评估问题，迄今为止未见有耐冷基因成功应用于生产的报道。目前报道的耐冷水稻种质多为野生稻或粳稻，其农艺性状较差，难以直接利用，而籼稻耐冷种质资源则较为稀缺。

根据前人的研究结果，水稻苗期耐冷性与芽期、孕穗期、开花期的耐冷性相关，可以将苗期的耐冷性鉴定结果作为生育后期耐冷性评价的重要参考指标［13-14］。笔者自2013年起，选择农艺性状好的粳稻和籼稻栽培稻为供试材料，开展水稻秧苗期耐冷种质资源筛选，以期获得农艺性状好、易于利用的强耐冷水稻种质资源，为耐冷育种提供耐冷亲本。同时，以耐冷新种质为材料，发掘优异耐冷基因（QTL），开发与耐冷性紧密连锁的分子标记或者基因功能标记研究，为耐冷分子育种提供基础。

1　材料与方法

1.1供试材料

以‘丽江新团黑谷’为耐冷对照，以‘桂99’为冷敏感对照，从“广东省水稻种质资源库”以及南方稻区收集的150份材料中初步筛选出田间有一定耐冷性、农艺性状较好的18份作为本试验的供试材料，列于表1。

表1　供试材料及人工气候箱低温胁迫处理时期（2013，广州）

1.2试验方法

试验采取盆栽直播。泥土的处理：碎土→过筛→消毒（高压锅灭菌）→拌肥→称量土（保证每个盆的土量相同）。种子浸种24 h后发芽，每个供试材料选取发芽较好且接近一致的种子52粒播于长×宽×高=56 cm×38 cm× 8 cm的塑料盆中，每行播13粒、每1个材料播4行。幼苗进入人工气候箱前在网室自然条件下生长。播种期为3月25日，处理时期为播种后20天（三叶一心期，见表1）。低温胁迫处理方法为人工气候箱低温胁迫，低温胁迫设置：根据广东生产上历年烂秧的实际情况，模拟广东重烂秧天气［2］，采取日均温8.5℃进行人工低温胁迫，人工气候箱具体设置见表2。处理时间分别为3天和6天。

调查内容：每个供试材料每个处理设3次重复，每个重复用记号笔标记10株用于定株调查，调查内容包括叶龄、株高、幼苗死亡率。进箱当天未入箱处理时调查1次、入箱处理3天、6天分别调查一次。幼苗死亡率调查在低温处理3天、6天后移至原来生长的网室条件下，让其恢复生长10天进行。

表2　苗期低温胁迫人工气候箱温、光、湿设置（2013，广州）

数据统计：用EXCEL整理试验数据，方差分析用SPSS 16.0统计软件进行。

2　结果与分析

2.1自然气候条件下各供试材料的生长状况

早春的低温、阴雨是影响水稻秧苗生长、高产、稳产的重要限制因素之一［15］。由于试验场所与广州气象站（23º08′N，113º19′E，海拔11.3 m）空中直线距离不到1 km，本试验采用广州气象站的气象因素记录作为本研究的气象资料。对照广州气象站本试验期间的气象资料，本试验期间气候条件适宜水稻生长［16］。因此，本试验中的低温胁迫仅为人工气候箱处理的单一效应，不存在自然灾害天气引起的叠加效应。

2.2各供试材料植株形态对低温胁迫的响应

水稻的整个生育期都会受到低温胁迫的影响，不同生育时期对低温胁迫的响应不同。营养生长期发生的低温胁迫，导致水稻生长缓慢并受阻，叶片变黄、变白，分蘖减少［2］。秧苗期水稻地上部的发育进程主要反应在主茎叶片数和株高的增长上。研究结果显示：①水稻秧苗经人工低温胁迫后，各供试材料的生长发育明显减缓受阻，无论是低温胁迫3天还是6天，各供试材料的主茎叶片数、株高与进箱当天差异不显著。②对心叶高而言，无论是入箱低温胁迫3天与进箱当天相比（F=6.5794＞F0.01=2.394），还是低温胁迫6天与3天相比（F=4.363＞F0.01=2.394），各供试材料心叶高增长差异均达到极显著水平。③进而对不同低温处理时间各供试材料心叶高增长量进行最小显著差法（LSD）多重比较，结果列于表3。由表3可知，‘丽江新团黑谷’、‘粳44’、‘苗110’、‘2-319’、‘华占’等材料在低温胁迫3天或6天，心叶高均增长明显，尤其是低温胁迫6天后，其心叶高增长量与对照‘桂99’达显著或极显著水平；‘粳44’在日均温8.5℃的人工低温胁迫下其生长势与强耐冷对照‘丽江新团黑谷’相当。

2.3低温胁迫对供试材料幼苗死亡率的影响及苗期耐冷种质资源筛选

表4所列为各供试材料8.5℃人工低温胁迫3天、6天后移至自然气候条件下恢复生长10天的幼苗死亡率。方差分析结果显示：①经人工气候箱低温胁迫后，不论是处理3天还是6天，各供试材料幼苗死亡率差异达到极显著水平。②所有供试材料中，对照‘丽江新团黑谷’耐冷性最强，8.5℃人工低温胁迫6天后幼苗死亡率仅14.43%；其次是‘粳44’，8.5℃人工低温胁迫6天后死亡率仅23.37%；籼稻‘2-319’、‘华占’和籼粳交后代品种‘苗110’耐冷性也较强，8.5℃人工低温胁迫3天后死亡率在30%以下。

3　讨论与结论

3.1耐冷种质资源筛选进展

人工气候箱低温胁迫会导致水稻秧苗生长发育明显减缓受阻；总体来说，粳稻的耐低温胁迫能力强于籼稻，这与前人的研究报道一致［17，18］。然而，中国南方稻区以籼稻为主，籼稻耐冷育种进展缓慢，其主要瓶颈是缺乏籼稻耐冷种质资源。特别近年来，极端气候频现，水稻冷害问题尤为突出。培育耐冷品种是解决冷害最直接有效的方法，然而耐冷种质资源是耐冷种质创制和新品种培育的基础。

表3　低温胁迫处理后各供试材料心叶高增长情况

表4　低温胁迫后各供试材料幼苗死亡率%

续表4

本研究采取人工气候箱低温胁迫法（日均温8.5℃），以低温胁迫后的幼苗死亡率为主要指标，辅以供试材料植株形态对低温胁迫的响应结果，筛选出耐冷粳稻材料1个（‘粳44’），耐冷籼稻材料2个（‘华占’、‘2-319’），耐冷籼粳交后代品种1个（‘苗110’）。这不仅丰富了粳稻耐冷种质资源，而且填补了籼稻耐冷资源的空缺，为籼稻耐冷育种和水稻冷害基础理论研究提供了坚实的物质支撑。

3.2水稻苗期耐冷鉴定方法及评价

目前有关水稻耐冷性鉴定的方法主要有两种，一是利用自然低温条件进行鉴定，如分期播种，异地、垂直带播种，冷水灌溉等；二是人工气候法，如人工气候箱低温胁迫。利用自然低温条件进行鉴定简单易行，但自然状态下是否发生低温或当低温发生时的强度、持续时间均无法人为控制，试验条件很难控制，无法重复，所得数据材料精确度较差。虽然人工气候箱使用成本大，但人工气候箱低温胁迫可以弥补自然低温鉴定这一局限，鉴定结果重复可靠［2］。本研究采用人工气候法，严格控制温度、湿度和光强，进行水稻耐冷种质资源筛选，结果精确可靠。

有关水稻苗期耐冷评价指标很多，生理指标如叶绿素含量，根系活力，过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等酶活性变化，丙二醛（MDA）含量变化、电解质渗透率等等，形态指标有叶片的萎蔫程度、幼苗死亡率、低温处理后的苗高、苗重，以及叶片卷枯程度及失绿程度等。生理指标测定繁琐，重复性差；众多形态指标中，幼苗死亡率鉴定水稻苗期耐冷性不仅直观，而且度量简单、精确客观［19］。

3.3耐冷种质资源的利用

本试验筛选出的苗期耐冷种质‘苗110’是籼粳交后代，其农艺性状表现籼稻的特点，又遗传了粳稻的耐冷特点，这种籼粳杂交的方法创制耐冷材料，为籼稻耐冷种质创制展示了一条非常有前景的途径。

本研究筛选到耐冷籼稻品种‘华占’，是近年来中国新选育的优良籼型三系恢复系。该恢复系不仅恢复力和一般配合力好，而且株型挺拔、米质优、高抗稻瘟病、适应性广，目前为止已有大批由其配制的杂交稻组合在生产上应用。本研究结果显示华占具有强耐冷性，这可能也是决定‘华占’配制的杂交稻组合具有适应性广特点的重要因素之一。因此，在遗传育种中，对耐冷种质的培育与应用具有重要意义。另一方面，用‘华占’、‘2-319’、‘苗110’、‘丽江新团黑谷’和‘粳44’等耐冷种质进行耐冷遗传分析及基因鉴定研究，为探寻粳稻和籼稻耐冷机制，并通过分子标记辅助育种手段将耐冷基因转到水稻优良品种中，培育籼型耐冷水稻新品种提供了非常好的种质资源。

3.4结论

秧苗期日均8.5℃的人工气候箱低温胁迫会导致水稻秧苗生长发育明显减缓受阻，各供试材料对低温胁迫的响应差异达极显著水平。就心叶高而言，无论是入箱低温胁迫3天与进箱当天相比（F=6.5794＞F0.01=2.394），还是低温胁迫6天与3天相比（F=4.363＞F0.01=2.394），各供试材料心叶高增长差异均达极显著水平。经人工气候箱低温胁迫后，不论是处理3天还是6天，各供试材料幼苗死亡率差异达极显著水平；总体上粳稻的耐冷性强于籼稻。以低温胁迫3天和6天后各供试材料自然气候条件下恢复生长10天的幼苗死亡率为指标评价鉴定其耐冷能力，‘粳44’耐冷性强，8.5℃人工低温胁迫6天后死亡率在25%以下；其次是‘苗110’、‘2-319’和‘华占’；‘源宝占’、‘苗108’耐冷能力中等，‘318’、‘R2168’、‘创丰1号’、‘耐寒2号’、‘R55’、‘金昌B’、‘湘中籼3号’、‘R308’、‘穗1225’、‘2-358’、‘合美占’、‘创香5号’、‘桂99’等耐冷性弱；其中‘华占’、‘2-319’为籼稻，‘苗110’为籼粳交后代，可应用于籼稻耐冷育种。

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Selection of Rice Resources Resistant to Cold at Seedling Stage

Zhou Xinqiao1，2，Chen Dagang1，2，Li Lijun1，Liu Chuanguang1，2，Li Juchang1，Chen Youding1，2

（1Rice Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2Guangdong Key Laboratory of New Technology in Rice Breeding，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

For exploring cold tolerant gene resource in rice，especially in indica rice，to promote cold tolerant rice breeding，18 germplasms，which were selected from 150 accessions collected from"rice germplasm repository of Guangdong Province"and the rice region in southern China，were used in the cold resistant rice germplasm screening test at the seedling stage.‘Lijiangxintuanheigu’was employed as cold-tolerant control and‘Gui 99’was employed as cold-sensitive control in the test.The test for screening cold tolerant germplasms was carried out in phytotron by low temperature stress（PGV-36，the mean daily temperature 8.5℃）method.The results showed that：（1）the growth and development of the tested materials slowed significantly under the low temperature stress，even stopped as the treatment went on；（2）under low temperature stress for 3 d or 6 d，the death rate of the tested materials was different significantly but the cold tolerance of japonica rice on the whole was better than that of the indica rice；（3）the death rate of the tested materials，which continued to grow 10 days under the natural environment after 3d or 6d low temperature stress，was employed as the evaluation index of cold tolerance，the cold tolerance of‘Jing 44’was the strongest，as its death rate was less than 25%after 8.5℃low temperature stress for 6 days，the second was‘Miao 110’，‘2-319’and‘Huazhan’，the cold tolerance of‘Yuanbaozhan’and‘Miao 108’was medium，but that of the other 12 germplasms such as‘318’，‘R2168’and‘Chuangfeng 1’，etc was weak.In the cold

tolerant germplasms，‘Huazhan’and‘2-319’was indica rice，‘Miao 110’was derived from the cross of indica and japonica，they all could be applied to cold tolerance breeding in indica rice.

Rice；Cold Tolerance；Germplasm；Screening；Seedling Stage

S511

A论文编号：cjas16040023

广东省主体科研机构创新能力建设专项“水稻生理生态与栽培研究平台建设”（粤科规财字［2014］208号）。

周新桥，女，1976年出生，湖南安化人，助理研究员，硕士，研究方向为水稻生态育种。通信地址：510640广州市天河区五山街道金颖东一街3号广东省农业科学院水稻研究所，Tel：020-87596275，E-mail：13428860986@139.com。

陈友订，男，1962年出生，广东饶平人，研究员，博士，主要从事水稻遗传育种研究。通信地址：510640广州市天河区五山街道金颖东一街3号广东省农业科学院水稻研究所，Tel：020-87596275，E-mail：chenyoud@21cn.com。

2016-04-20，

2016-06-21。