王　焕

(河南省济源市人民医院药剂科,济源,454650)



榄香烯乳联合人参皂苷对卵巢癌细胞耐药株A2780/PTX的影响作用

王焕

(河南省济源市人民医院药剂科,济源,454650)

目的:观察榄香烯乳联合人参皂苷方案对卵巢癌细胞耐药株A2780/PTX的影响作用。方法:采用体外培养的卵巢癌细胞耐药株A2780/PTX进行实验,随机分成4组,空白组:新鲜的全培养液;人参皂苷组:30 μg/mL人参皂苷培养液;榄香烯乳组:20 μg/mL榄香烯乳培养液;联合组:30 μg/mL人参皂苷+20 μg/mL榄香烯乳培养液。通过流式细胞仪检测细胞周期;通过MTT法检测榄香烯乳及人参皂苷单用的细胞毒作用及2者联合应用时的作用;采用Western-blot观察A2780/PTX细胞内蛋白的表达;采用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化。结果:流式细胞术检测结果显示,与人参皂苷组、榄香烯乳组及空白组比较,联合组在G0/G1期细胞有明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),A2780/PTX细胞被阻止在G1期;MTT法检测结果显示不同浓度的药物剂量可以对卵巢癌细胞产生抑制作用,并呈一定的剂量依赖性;Western blotting结果显示,A2780/PTX细胞中联合组蛋白表达较空白组、人参皂苷组、榄香烯乳组显著降低(P<0.05);联合组A2780/PTX细胞株线粒体膜电位下降较人参皂苷组、榄香烯乳组及空白组更为明显(P<0.05)。结论:榄香烯乳联合人参皂苷方案能对卵巢癌细胞耐药株A2780/PTX产生明显的生长抑制作用。2者联合应用可以提高有效率,降低不良反应。

卵巢肿瘤;榄香烯乳;人参皂苷;A2780/PTX

卵巢癌是严重威胁女性健康的较为常见的一种恶性肿瘤。目前临床上的主要治疗手段是化疗,但化疗一段时间后肿瘤细胞会对化疗药物产生耐药性[1-3],进而降低化疗效果,给患者的治疗造成障碍。人参皂苷是从中药人参中提取,能提高患者自身免疫力,具有抗肿瘤活性,因其具有潜在的抑癌作用已被研究者认为是理想的抗癌药物[4-6]。另外从中药莪术中提取的非细胞毒性抗癌药榄香烯乳是一种新的化疗药物,其在卵巢癌的治疗中发挥重要作用,此药的有效成分是β-榄香烯,经研究发现β-榄香烯乳的不良反应较少,具有放射增敏效应,可逆转肿瘤细胞的耐药性[7-9]。本研究就人参皂苷与榄香烯乳联合应用,探讨此联合方案对卵巢癌细胞耐药株A2780/PTX的影响作用,现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1实验材料人卵巢癌A2780/PTX细胞购于南京凯基生物科技有限公司;人参皂苷购自天津马克生物技术有限公司(批号:41753-43-9);榄香烯乳剂注射液购自大连金港制药有限公司(批号:081152);DMEM培养液购于美国Gibco;蛋白定量试剂盒为美国Klontech公司产品;四甲基氮唑蓝(MTI7)为美国Sigma公司产品;小牛血清、DMEM培养液购于杭州四季青生物有限公司;细胞裂解液购自碧云天生物技术有限公司;HER-2兔抗人抗体及二抗均为Santa Cruz公司产品;蛋白酶抑制剂、磷酸化酶抑制剂购自南京凯基生物科技发展有限公司;紫外分光光度计、倒置显微镜购自日本TOYOBO公司;流式细胞仪购于美国Biorad公司。

1.2细胞培养用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养人卵巢癌A2780/PTX细胞,于37 ℃含5% CO2的空气培养箱中培养,2 d传代1次,取处于生长对数期的细胞用于实验。

1.3实验方法

1.3.1药物预处理及实验分组药物预处理:将卵巢癌A2780/PTX细胞以1×106个/mL的密度接种至6孔板中,于每孔加入DMEM 3 mL。人参皂苷、榄香烯乳先用DMSO溶解,然后用培养基稀释至终浓度。培养体系中人参皂苷的浓度为30 μg/mL,此时DMSO的终浓度为0.1%;榄香烯乳20 μg/mL。6 h后收集细胞悬液以1 000 r/min离心5 min收集细胞并用PBS清洗涤1遍。实验随机分成4组,空白组:新鲜的全培养液;人参皂苷组:30 μg/mL人参皂苷培养液;榄香烯乳组:20 μg/mL榄香烯乳培养液;联合组:30 μg/mL人参皂苷+20 μg/mL榄香烯乳培养液。

1.3.2流式细胞仪检测细胞周期收集上述分组的A2780/PTX细胞,调整细胞浓度为1×106个/L,以冷PBS洗涤两遍后,以70%的冷乙醇(4 ℃)将细胞沉淀并混匀备用,洗涤细胞后再调整细胞浓度为1×106个/L(用PBS)与含50 μg/mL RNA酶的Tris-HCL缓冲液(pH 7.4)共同孵育30 min。100 μg/mL(1 μg/mL)碘化丙啶(PI)进行细胞的DNA染色,放置暗室中1 h后,经流式细胞仪检测细胞的DNA含量分布,并计算出各周期细胞所占的百分比。

1.3.3MTT法检测榄香烯乳及人参皂苷单用及2者联合应用时的细胞毒作用MTT法测定人参皂苷、榄香烯乳对A2780/PTX细胞的毒性:细胞贴壁后,于空白组加入新鲜的全培养液;人参皂苷组加入终质量浓度为分别为:10、20、30、40 μg/mL人参皂苷培养液;榄香烯乳组加入终质量浓度为分别为:10、20、30、40 μg/mL榄香烯乳培养液;联合组分别联合加入上述2组不同浓度的培养液(用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释)。药物作用72 h后于每孔加入5 mg/mL的MTT溶液继续培养4 h,离心后弃上清,置摇床上低速振荡10 min。采用全自动酶标仪(检测490 nm处的吸光度值(A值),取平均值计算细胞生长率。规定生长率>95%的药物浓度为该药的非细胞毒性剂量,并作为最佳逆转耐药浓度。

1.3.4Westem blot观察A2780/PTX细胞内蛋白的表达于每组收集生长状态良好的卵巢癌A2780/PTX细胞1×106个,弃去培养液后用PBS冲洗3次,提取总蛋白,通过BCA法测定蛋白质浓度,吸取50 μg总蛋白,行10%SDSPAGE电泳,通过电转移(40V 150 min的转印条件)印迹到PVDF膜上,封闭5%脱脂奶粉FIBS液中,于37 ℃下孵育2 h。加入1∶1 000稀释的一抗孵育,4 ℃过夜,用TBST洗膜5次,5 min/次;加入1∶5 000 HRP标记的二抗孵育,于37 ℃培育2 h,经PBS冲洗,采用ECL法检测。于暗室曝光X线片,通过GDSS000凝胶自动成像系统摄像,漂洗并干燥后避光保存。Image-Pro Plus 8.0软件分析条带灰度值,以A2780/PTX/β-actin代表A2780/PTX的相对表达量。

1.3.5采用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化激光共聚焦荧光显微镜检测2种药物对A2780/PTX细胞线粒体膜电位(△Ψm)的影响,各组以不同浓度药物作用72 h后,加入无血清培养基稀释的线粒体荧光染料(JC-1)(终浓度为10 mg/L),于37 ℃下培养15 min,离心5 min后弃除多余染料,在各组均制片3张,放于激光共聚焦显微镜下进行扫描、拍照。JC-1单体在激发波长为488 nm,发射波长为530 nm处能检测到绿色荧光,JC-1聚合物在激发波长为535 nm，发射波长为590 nm处检测到红色荧光。选择5个不重复视野,并对其平均荧光密度进行计算,以红色荧光/绿色荧光光密度比值表示线粒体△Ψm的高低,比值降低提示线粒体△Ψm下降。

2　结果

2.1流式细胞仪检测细胞A2780/PTX周期流式细胞术检测结果显示,空白组细胞主要分布在G0/G1期,人参皂苷组、榄香烯乳组在G0/G1期细胞较对照组增加,人参皂苷组、榄香烯乳组与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05),人参皂苷组及榄香烯乳组之间差异无统计学意义(P>0.05);联合组在G0/G1期细胞与人参皂苷组、榄香烯乳组及空白组比较有明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),提示A2780/PTX细胞被阻止在G1期。见表1。

表1　A2780/PTX细胞周期的检测

注:与人参皂苷组、榄香烯乳组及空白组比较,*P<0.05。

2.2MTT法检测细胞毒作用MTT法检测结果显示不同浓度的药物剂量可以对卵巢癌细胞产生抑制作用,并呈一定的剂量依赖性。但随着2种药物浓度的提高,对A2780/PTX细胞生长的抑制情况明显上升。2种药物在中高浓度时,抑制肿瘤细胞生长的作用尤为显著,并呈一定的剂量依赖性,且中高浓度时能产生更严重的对细胞形态结构破坏的损伤。根据本研究结果以及参考文献[10]，我们选择30 μg/mL浓度的人参皂苷及20 μg/mL浓度的榄香烯乳作用A2780/PTX细胞24 h为研究2种药物逆转A2780/PTX细胞耐药性的最适浓度和时间。不同浓度药物抑制A2780/PTX细胞生长情况见表2、图1。

表2　人参皂苷及榄香烯乳对A2780/PTX细胞生长的抑制情况

注:*P<0.05。

2.3Westem blot检测A2780/PTX蛋白的表达Western blotting结果显示,A2780/PTX细胞中联合组蛋白表达较空白组、人参皂苷组、榄香烯乳组显著降低(P<0.05)。见表3。

图1　不同浓度药物的吸光度值

组别A2780/PTXprotein空白组098±023∗人参皂苷组085±016∗榄香烯乳组084±032联合组073±012∗

注:与人参皂苷组、榄香烯乳组及空白组比较,*P<0.05。

图2　Western blot检测A2780/PTX细胞的protein的表达

图3　细胞内线粒体膜电位的荧光强度(×400)

2.4人参皂苷及榄香烯乳对A2780/PTX细胞株线粒体膜电位的影响结果显示,在药物最适浓度下作用24 h后,空白组细胞(图3a)可见红色荧光,胞膜完整,胞核清晰可见,表明线粒体△Ψm没有明显变化;人参皂苷组(图3b)、榄香烯乳组(图3c)可见部分细胞呈现红色荧光,部分细胞呈现绿色荧光,还有部分细胞呈破裂状,胞内可见内容物外流,提示线粒体△Ψm有所下降;联合组(图3 d)中显示大量细胞呈现绿色荧光,部分细胞出现核固缩、部分细胞呈破裂状,胞内可见内容物外流,表明线粒体△Ψm有显著下降。

3　讨论

卵巢癌是妇科较为常见的恶性肿瘤之一,严重影响着女性的生命健康。目前主要治疗手段是以手术切除为主,辅助药物化疗的综合治疗。因其发病隐匿,多数患者发现时已属中、晚期,而晚期卵巢癌患者的生存率较低,尤其是5年生存率仅为30%左右[10],对化疗药物产生耐药性是导致化疗失败及影响5年生存率的主要原因。因此对卵巢癌细胞耐药机制的研究是目前的热门领域。

近年来随着中药及中医技术的发展,中药资源越来越丰富,且中药作用靶点较多,具有针对多药耐药机制复杂的特点。我国自行研发的抗癌新药榄香烯乳注射液就是一种可以逆转多药耐药的中药[11]。研究发现作为其主要成分的β-榄香烯,其具有抑制肿瘤细胞DNA的合成,降低肿瘤细胞的增殖能力,同时具有增强机体T淋巴细胞亚群的功能,发挥加强免疫作用等的优点[12-13]。其所具有的逆转多药耐药途径的作用已被多项研究所证实。此外多项研究均表明,人参皂苷可以通过不同途径抑制肿瘤细胞的生长[14-15]。人参皂苷可通过调节凋亡相关基因的表达及活性,诱导肿瘤细胞的凋亡;可通过抑制药物向细胞外流动而逆转肿瘤细胞的耐药性;还可通过抑制肿瘤血管生成、减低细胞黏附性及调节细胞内钙离子浓度等途径抑制肿瘤的侵袭及转移。有研究表明,人参皂苷可加速外周淋巴细胞增殖,增强体液和细胞免疫[16]。

本研究采用低细胞毒浓度的人参皂苷和非细胞毒性抗癌药榄香烯乳联合干预卵巢癌细胞耐药株A2780/PTX。通过比较在总剂量不变的前提下,人参皂苷和榄香烯乳单独用药和2者联合用药后,卵巢癌细胞耐药株A2780/PTX的生长情况,通过流式细胞术检测结果显示,联合组在G0/G1期细胞与人参皂苷组、榄香烯乳组及空白组比较有明显增加,A2780/PTX细胞被阻止在G1期,表明2者联合应用可以增强抑制肿瘤细胞生长的效应;通过MTT法检测结果显示在不同浓度的药物剂量时,对卵巢癌细胞产生抑制作用,并呈一定的剂量依赖性,且联合组的抑制作用大于单独用药组,提示2者联合应用促进肿瘤细胞的逆转耐药作用会增强;Western blotting结果显示,A2780/PTX细胞中联合组蛋白表达较空白组、人参皂苷组、榄香烯乳组显著降低,提示联合应用可进一步使癌细胞增殖能力下降;不同浓度的人参皂苷及榄香烯乳联合能使A2780/PTX细胞株线粒体膜电位下降,表明细胞线粒体膜受到损伤,从而诱导了细胞的凋亡。

综上所述,人参皂苷和榄香烯乳联合干预具有明确的抗肿瘤作用。但是本实验结果尚缺乏相关机制的研究,此外还需通过大量临床病例资料进行深入研究与佐证。

[1]Dai ZJ,Tang W,Lu WF,et al.Antiproliferative and apoptotic effects of β-elemene on human hepatoma HepG2 cells[J].Cancer Cell Int,2013,13(1):27.

[2]杨春肖,黄运兰,司立慧,等.人参皂苷Rh2对人卵巢癌细胞的作用及其机制的研究[J].中国妇幼保健,2012,27(32):5162-5165.

[3]Greither T,Koser F,Kappler M,et al.Expression of human Piwi-like genes is associated with prognosis for soft tissue sarcoma patients[J].BMC Cancer,2012,12:272.

[4]李冬,王旋,戴燕,等.抗菌肽LL-37在巨噬细胞促卵巢癌细胞增殖中的作用[J].中华肿瘤杂志,2013,35(9):660-665.

[5]Hagemann S,Wohlschlaeger J,Bertram S,et al.Loss of Survivin influences liver regeneration and is associated with impaired Aurora B function[J].Cell Death Differ,2013,20(6):834-844.

[6]王翠英,宋春燕.参麦注射液治疗卵巢癌临床研究[J].中医学报,2013,28(4):471-472.

[7]Hetland TE,Nymoen DA,Holth A,et al.Aurora B expression in metastatic effusions from advanced-stage ovarian serous carcinoma is predictive of intrinsic chemotherapy resistance[J].Hum Pathol,2013,44(5):777-785.

[8]张小风,蔡元训.参麦注射液联合化疗治疗恶性肿瘤疗效观察[J].浙江中西医结合杂志,2006,15(12):741-742.

[9]刘寨东,齐元富,李秀荣,等.六神丸抗肿瘤实验研究现状[J].中医学报,2011,10(7):519-520.

[10]金英慧,何津,徐红梅,等.人参皂苷Rh2联合顺铂对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响[J].中国妇幼保健,2012,27(9):1398-1400.

[11]高岩,林英嘉,李杨,等.人参皂苷代谢产物CK诱导卵巢癌细胞CAOV3的凋亡机制[J].中国生物制品学杂志,2015,28(2):142-146.

[12]田红,于鹏,吴小茗,等.卵巢癌的治疗药物研究进展[J].现代药物与临床,2015,30(1):103-107.

[13]陈鲁,屠珏,张英丽.人参皂苷Rg3与顺铂对荷卵巢癌裸鼠免疫功能及肿瘤相关蛋白的影响[J].肿瘤学杂志,2014,20(11):914-919.

[14]孙倩,肖玲.人参皂苷Rh1诱导卵巢癌细胞凋亡及对piwi基因的表达影响[J].中国现代医学杂志,2013,23(3):1-5.

[15]陈鲁,朱笕青,钱丽娟,等.人参皂苷Rg3与顺铂对高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM细胞周期和转移抑制的影响[J].浙江医学,2009,31(2):169-172.

[16]许天敏,崔满华,谷丽萍,等.20(S)-人参皂苷Rg3对卵巢癌生长抑制作用的实验研究[J].中国实用妇科与产科杂志,2007,23(2):108-110.

(2015-09-04收稿责任编辑：王明)

Elemi olefinic emulsion joint ginseng saponin on ovarian cancer cell A2780/PTX impact resistant strains

Wang Huan

(Jiyuan city of henan province people′s hospital pharmacy department，Jiyuan 454650,China)

Objective:To observe the elemi olefinic emulsion combined ginseng saponin scheme on ovarian cancer cell A2780/PTX impact resistant strains.Methods:Using vitro cultured ovarian cancer cell A2780/resistant strains PTX experiment，randomly divided into 4 groups：blank group：just add fresh whole culture; Ginseng saponin groups：30 mu g/mL culture ginsenosides; Elemi ene group：20 mu g/mL olive incense ene milk culture medium; Joint group：30 mu g/mL + 20 mu g/mL ginsenosides elemi milk culture medium.By flow cytometry instrument to detect cell cycle; Lam incense ene milk by determined by MTT method and use the cytotoxic effect of ginsenosides and their joint application; Using Western blot observation A2780/PTX protein expression in the cell; With laser confocal microscope detection of mitochondrial membrane potential changes.Results:Flow cytometry detection，according to the results and ginseng saponin，lam incense ene milk group and the blank group comparison，the joint group of cells in G0/G1 phase increased markedly，and the statistical significant difference(P<0.05)，A2780/PTX cells in G1 phase is blocked; Determined by MTT method to detect the result shows that different concentrations of doses can inhibitory effect on ovarian cancer cells，and a certain dose dependent;，according to the results of Western blotting A2780/zhonglian PTX cells to form protein expression than blank group，ginseng saponin，lam incense ene group significantly reduced(P<0.05); Joint group A2780/PTX cell lines of mitochondrial membrane potential decreased the ginseng saponins group，lam incense ene group and blank group is more obvious(P<0.05).Conclusion:Lam incense ene milk can joint scheme ginsenosides on ovarian cancer cell A2780/PTX resistant strains produce obvious growth inhibition.The joint application can improve the efficient，reduce the adverse reaction.

Ovarian cancer; Elemi olefinic emulsion; Ginseng saponin; A2780/PTX

王焕(1972.01—),女,本科,主管药师,研究方向:药学,E-mail:wanghuanjyyy@163.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.049