李木松　张贵贤　魏媛媛　刘震霞

(保定市传染病医院肝五A科,保定,071000)



茵陈蒿汤对肝纤维化大鼠肝组织内质网应激caspase-12通路的影响

李木松张贵贤魏媛媛刘震霞

(保定市传染病医院肝五A科,保定,071000)

目的:观察茵陈蒿汤对胆汁瘀积性肝纤维化大鼠肝组织内质网应激caspase-12通路的影响,探讨茵陈蒿汤抗胆汁瘀积性肝纤维的作用机制。方法:将35只SD大鼠分为假手术组和造模组,采用胆总管结扎法复制胆汁瘀积性肝纤维化大鼠模型,1周后将造模组动物分为模型组和中药组,中药组予以3.5 g/kg茵陈蒿汤灌胃,4周后处死动物,HE、Masson染色观察肝脏组织病理学变化;Western blot法检测各组大鼠肝脏GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表达变化。结果:肝脏组织病理学变化显示模型组大鼠肝纤维化程度较假手术组明显增加(P<0.05),中药组大鼠肝纤维化程度较模型组减轻(P<0.05),但仍重于假手术组。Western blot结果显示,模型组肝脏GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白的表达与假手术组相比显著升高(P<0.01),中药组较模型组eIF2α和Caspase-12明显降低(P<0.01)。结论:抑制eIF2α和Caspase-12的活化,从而减少肝细胞凋亡,进而抑制内质网应激在胆汁瘀积性肝纤维化中的促进作用,是茵陈蒿汤抗胆汁瘀积性肝纤维化的作用机制之一。

胆汁瘀积性肝纤维化;茵陈蒿汤;内质网应激;细胞凋亡;Caspase-12

肝纤维化的发生发展与肝细胞的凋亡密切相关,抑制肝细胞凋亡可有效地防止肝纤维化的进展[1-2]。内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)与细胞凋亡及器官纤维化的发生发展关系密切[3-4]。Caspase-12是内质网特有的Caspase,Caspase-12的活化可诱发凋亡蛋白酶级联反应。茵陈蒿汤有较好的保护肝细胞、抗肝纤维化作用[5-6],本研究通过观察茵陈蒿汤对肝组织内质网应激Caspase-12通路的影响,进一步阐明茵陈蒿汤防治肝纤维化的作用机制。

1　材料与方法

1.1动物及试剂35只SPF级雄性SD大鼠,体质量(180±20) g,由河北医科大学实验动物中心提供。HE染液和Masson染液购自福州迈新生物技术公司;细胞组织裂解液RIPA和蛋白酶抑制剂PMSF购自上海碧云天公司;丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺购自美国Sigma公司;GRP78、eIF2α和Caspase-12和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2药品制备茵陈蒿汤《伤寒论》由茵陈18 g,栀子12 g,大黄(去皮)6 g,根据《中药药理研究方法学》大鼠剂量=人剂量×35(人转换因子)/6(大鼠转换因子)计算出人鼠等效剂量为3.5 g/kg。按传统工艺制备成水煎剂,减压浓缩至0.35 g/mL备用。

1.3实验方法将实验动物随机分为造模组(25只)和假手术组(10只),采用胆管结扎法复制胆汁瘀积性肝纤维化模型。术前禁食不禁水12 h,用盐酸氯胺酮肌肉注射进行麻醉(100 mg/kg),常规皮肤消毒后,沿腹部正中线切开皮肤以充分暴露胆总管,于胆总管远近端分别结扎后从中间离断,关腹;假手术组仅开腹暴露并游离胆总管但不结扎,关腹。于造模1周后,造模组随机分为模型组(11只),中药组(各12只)。于4周末处死动物。按造模时方法盐酸氯胺酮麻醉,腹主动脉采血,分离血清,-80 ℃冰箱保存。取全肝脏称重后,于肝右叶固定位置切取1.0 cm×1.0 cm大小2块肝组织,中性甲醛溶液固定,石蜡包埋后行HE、Masson染色;其余肝组织于液氮中速冻后转移至-80 ℃冰箱保存备用。

1.4病理学检查将甲醛固定后的肝组织行石蜡包埋,苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色胶原纤维染色,400倍光镜下观察肝组织病理变化。肝纤维化程度参照文献[7],每个“+”记1分,总积分越高,表明肝脏纤维化程度及病理损害越重。

1.5Western blot法检测肝组织GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表达在缓冲液样品中将细胞裂解进行SDS-PAGE检测。聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转移法将蛋白转移至PVDF滤膜上。用5%的脱脂牛奶封闭3 h,将膜用兔抗大鼠单克隆培养。免疫反应性蛋白用增强的化学发光试剂显影。ECL显色,Quantity One软件测定分析结果。采用β-actin作为内参照,以光密度比值表示该蛋白相对表达水平。

2　结果

2.1一般情况模型组大鼠体质量较假手术组增长缓慢,2 d后开始出现小便发黄,7 d后在尾巴、耳朵、皮毛出现黄染,胆总管渐进性扩张,肝脏体积增大,色泽黄染,第3～4周肝脏质地逐渐变硬,4周表面呈桔皮样,弹性明显降低。有4只动物在造模后第1周和第4周因消化道出血和腹水死亡。

2.2肝组织病理学变化HE和Masson染色显示,假手术组大鼠肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射状排列,肝小叶结构清晰,有少量炎性细胞浸润,无明显坏死,无胶原纤维增生;模型组肝索排列紊乱,汇管区纤维结缔组织大量增生,增生的胆管上皮细胞分化为小胆管,与纤维组织形成间隔,肝组织结构破坏严重,大量胶原组织沉积形成纤维间隔,可见假小叶形成;中药组可见增生的胆管上皮细胞周围有纤维组织增生,汇管区面积扩大,较模型组炎性细胞浸润和肝细胞坏死减少(P<0.05)。见图1,图2,表1。

图1　HE染色检测各组大鼠肝组织病理改变

图2　Masson三色染色检测各组大鼠肝组织病理改变

组别只数肝纤维化程度-++++++假手术组1010000模型组110344中药组101711

图3　茵陈蒿汤对胆汁瘀积性肝纤维化大鼠内质网应激Caspase-12通路的影响

2.3Western blot法检测茵陈蒿汤对胆汁瘀积性肝纤维化大鼠内质网应激Caspase-12通路的影响模型组大鼠与假手术组相比肝脏GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表达明显增多差异有统计学意义(P<0.01),中药组较模型组eIF2α和Caspase-12明显降低(P<0.01)。见图3,表2。

表2　茵陈蒿汤对胆汁瘀积性肝纤维化大鼠内质网应激Caspase-12通路的影响

注:**P<0.01,与假手术组比较;△△P<0.01,与模型组比较。

3　讨论

内质网参与新生蛋白质的合成、储存、加工修饰和运输。错误折叠蛋白在内质网腔过多聚积从而引发ERS[7]。ESR有利于恢复细胞内环境稳态,是一种重要的细胞自我防御机制,但高强度或持续的ERS则可通过激活下游Caspase-12的活化,继而诱发凋亡蛋白酶级联反应[8]。研究表明,ERS诱导的肝细胞凋亡参与了肝纤维化的发生机制[9]。葡萄糖调节蛋白-78(Glucose-regulated Protein,GRP78)是内质网稳态的感受器,应激状态下GRP78大量表达,与未折叠蛋白结合,恢复蛋白质的正确构象。因此,GRP78被认为是ERS的标志性分子。GRP78也通过磷酸化真核细胞起始因子2α(Eukaryotic Initiationfactor2α,eIF2α)抑制细胞蛋白质合成,并通过活化Caspase-12,发生凋亡蛋白酶级联反应[10]。Caspase-12位于内质网腔内,是内质网特有的Caspase,也是ERS介导细胞凋亡的一个主要调节因子[11],其活化是不依赖线粒体凋亡途径和细胞色素C来完成。ERS与细胞凋亡及器官纤维化密切相关[12-13]。

本研究发现,通过胆管结扎诱导的胆汁瘀积性肝纤维化模型大鼠肝组织结构紊乱,大量纤维结缔组织增生,胶原纤维形成纤维间隔,可见假小叶形成,纤维化程度积分明显增高,证明模型复制成功[14-15]。内质网应激的标志性蛋白GRP78表达增强,以及eIF2α和Caspase-12表达明显增加,提示在胆汁瘀积性肝纤维过程中发生了内质网应激,从而导致肝细胞凋亡的发生。茵陈蒿汤由茵陈蒿、栀子和大黄组成,首载于《伤寒论》,有保肝利胆退黄等功效[16],为临床上治疗湿热内蕴型肝胆疾病的首选方剂,本实验研究提示,茵陈蒿汤可明显改善胆汁瘀积性肝纤维化大鼠肝纤维化程度,提示该方具有抗胆汁瘀积所造成的肝纤维化作用。胆汁瘀积性肝纤维化大鼠肝脏GRP78、eIF2α和Caspase-12蛋白表达明显增加,用药后eIF2α和Caspase-12明显降低,提示抑制eIF2α的表达和Caspase-12的活化,从而减少肝细胞凋亡,进而抑制ERS在胆汁瘀积性肝纤维化中的促进作用,是茵陈蒿汤抗胆汁瘀积性肝纤维化的作用机制之一。

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(2015-09-21收稿责任编辑：王明)

Effects of Yinchenhao Decoction on Endoplasmic Reticulum Stress Pathway of Caspase-12 in Hepatic Fibrosis Rats

Li Musong, Zhang Guixian, Wei Yuanyuan, Liu Zhenxia

(Liver diseases five A department of Baoding Infectious Disease Hospital, Baoding 071000, China)

Objective:To observe the effects of Yinchenhao decoction on endoplasmic reticulum stress caspase-12 pathway of cholestasis liver fibrosis rat and its action mechanism on anti bile siltation liver fiber.Methods:Thirty five SD rats were divided into sham operation group and the duplicate model group. The common bile duct ligation method was used to replicate cholestasis liver fibrosis in rats. After 1 week of building, the rats were divided into model group and TCM group. TCM group was given3.5 g/kg Yinchenhao decoction by intragastric administration. The rats were killed after four weeks. HE and Masson staining method were used to observe the changes of the liver tissue pathology, and Western blot method was used to detect GRP78, eIF2 alpha and Caspase-12 protein expression changes in liver tissue of each group.Results:The liver histopathology examination showed that the liver fibrosis rat model was duplicated successfully. The degree of liver fibrosis in the TCM group was lower than that of the model group (P<0.05), but it was more severe than that of the Sham operation group. Blot Western showed that the expression of Caspase-12, eIF2α and GRP78 in the model group was significantly higher than those of the Sham operation group (P<0.01). Besides, eIF2α and Caspase-12 significantly decreased in the TCM group (P<0.01).Conclusion:Inhibiting eIF2α and caspase-12 activation, reducing apoptosis of liver cells, thereby inhibiting the promoting effect of ERS in the liver fibrosis of bile stasis is one possible action mechanism of Yinchenhao decoction in removing bile stasis liver fibrosis.

Cholestatic liver fibrosis; Yinchenhao decoction; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis; Caspase-12

李木松(1976.12—),男,本科,主治医师,肝五科主任,研究方向:中西医结合防治肝病,E-mail:602366035@qq.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.050