王珍+赵昌林+骆敏翔

[摘要]目的 构建含人HSP72的慢病毒，筛选获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。方法 采用PCR方法从MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA中调取HSP72基因的完整序列，利用双酶切及体外重组的方法获得pLV-HSP72-EGFP（2A）质粒，经PCR、测序方式鉴定成功后，对病毒进行包装。用病毒感染hUC-MSC，并用Puro进行抗性筛选可稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。结果 构建的pLV-HSP72-EGFP（2A）测序结果与GenBank收录序列一致，包装得到pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒，筛选获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系，ELISA方法检测显示获得的细胞株可过表达HSP72。结论 构建了获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。

[关键词]HSP72；人脐带间充质干细胞；慢病毒载体；转染

[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（b）-0004-05

[Abstract]Objective To construct Lenti-viral Vector carrying human HSP72 gene，and to screen the hUC-MSC cell line with stable expression of HSP72.Methods The human HSP72 cDNA was amplified from "MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA" by PCR.pLV-HSP72-EGFP （2A） plasmid was obtained by double enzyme digestion and in vitro recombination，then was confirmed by PCR and DNA sequencing.The pLV-HSP72-EGFP （2A） virus was packaged.hUC-MSC was infected by the virus，and the hUC-MSC cell lines stably expressing HSP72 were screened by Puro.Results The recombinant pLV-HSP72-EGFP （2A） was constructed.The sequence was consistent with that reported in GenBank.The pLV-HSP72-EGFP （2A） virus was packaged and infected hUC-MSC.By ELISA，it was confirmed that the HSP72 protein could be expressed and secreted into the supernatant of hUC-MSC strain culture.Conclusion hUC-MSC cell line with stable expression of HSP72 is constructed.

[Key words]Heat shock protein 72；Human umbilical cord mesenchymal stem cell；Lenti-viral Vector；Transduction

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年痴呆中最常见的一种类型，其患病率随年龄增高而升高，在65岁以上人群中约为5%，85岁以上人群中约为20%[1]。有研究结果发现，分子伴侣的主要成分HSP72可以通过减少Aβ的聚集，促进Aβ的清除，减少tau蛋白的过度磷酸化，减少神经元的丢失，促进神经突触的可塑性等途径参与AD发病进展的多个环节，是防治AD的非常有价值的靶点之一[2]。基因治疗是近年来研究热度非常高的一种治疗策略，借助基因治疗，寻找一种稳定、长效脑内表达HSP72的给药方法和策略值得进一步探讨。本研究通过第三代慢病毒载体系统，将HSP72插入慢病毒载体，并选择具有神经细胞分化潜能、来源丰富、无伦理学争议的人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）作为工具细胞，建立一种HSP72过度表达与hUC-MSC移植结合起来的治疗方法和策略，为进一步动物实验疗效评估和应用安全性评估奠定基础。……