庞欢瑛，黄芝凤，黄 洋，黄郁葱，鲁义善，简纪常

（广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江　524088）

五味子和黄精对副溶血弧菌及其生物膜的体外抑制作用

庞欢瑛，黄芝凤，黄 洋，黄郁葱，鲁义善，简纪常

（广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江524088）

采用琼脂扩散法，分别测定五味子（Shisandra chinensis）、黄精（Polygonatum sibiricum）对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的体外抑菌作用；选用倍比稀释法确定五味子、黄精对副溶血弧菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）；采用改良微孔板法（MTT）评价两种中草药液对溶藻弧菌生物膜形成的影响。结果表明，两种中草药都有不同程度的抑制副溶血弧菌的作用，五味子对副溶血弧菌的抑菌圈直径为18.67（±0.2）mm，MIC为1.56 mg/mL，MBC为3.125 mg/mL；黄精的抑菌圈直径为11.26（±0.6）mm，MIC和MBC分别为1.56、3.125 mg/mL。当药物浓度达到3.125 mg/mL以上时，五味子和黄精对副溶血弧菌生物膜的形成有极显著抑制作用。

五味子；黄精；副溶血弧菌；体外抑制作用；生物膜

庞欢瑛，黄芝凤，黄洋，等. 五味子和黄精对副溶血弧菌及其生物膜的体外抑制作用［J］.广东农业科学，2016，43（9）：119-123.

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）属于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌属（Vibrio），是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌，广泛存在于沿岸海水、海河交界处及水生动物中，能引起鱼、虾、蟹和贝类等多种养殖动物的疾病［1-2］，给水产养殖业带来严重的经济损失。此外，副溶血弧菌能导致食物中毒，严重危害人类健康［3］。生物膜（Biofilm）是细菌在自然界中为了抵抗外界不利因素而形成的微生物群体结构，是微生物（如细菌）最主要的存在方式［4］。副溶血弧菌形成生物膜后能更强烈地抵御抗生素药物的杀灭作用（即产生抗药性）［5］，同时也能更有效逃避宿主细胞的免疫作用，给弧菌病的预防和治疗造成困难。因此，关于弧菌生物膜防治的研究成为当前弧菌病防治的热门研究课题之一。

中草药是我国医学宝库中最珍贵的财富之一，许多中草药含有抗菌活性强、毒性低的有效成分。五味子（Shisandra chinensis）属于木兰科五味子族五味子属，俗称玄及、山花椒、五梅子、壮味、五味，其果实、种子、藤茎均可入药［6］。五味子富含维生素、植物固醇、有机酸、类黄酮及木脂素［7］，具有降酶保肝、保护中枢神经系统、抗肿瘤、抗衰老、抑菌等作用［8］。黄精（Polygonatum sibiricum）又名爪子参、鸡爪参、鸡头黄精、老虎姜、黄鸡菜，为晒干或烘干后的百合科植物黄精等的根茎。黄精根茎含有丰富的黄精多糖、甾体皂苷、蒽醌、强心苷、木质素［9］，临床上用于治疗肺结核、癣菌病，药理上具有抗病原微生物、抗病毒及抗炎作用［10］。五味子和黄精是常用的中草药，它们在防治水产动物疾病中有着广泛的应用。吴颖瑞等采用琼脂扩散法测定了153种中草药乙醇提取物对罗非鱼海豚链球菌的抑菌活性，发现北五味子对海豚链球菌具有明显的抑菌活性［11］。陈辉等采用琼脂扩散法测定100种常见中草药提取液对溶藻弧菌的抑制作用，发现黄精的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）均为500 mg/mL，五味子的MIC和MBC均为1 000 mg/ mL［12］。目前，尚鲜见关于五味子和黄精对副溶血弧菌及其生物膜抑制作用的报道。本研究通过测定五味子和黄精对副溶血弧菌及其生物膜的体外抑制作用，探索这两种中药的抑菌和抗生物膜功能，为今后应用中药防治由该菌引起的弧菌病提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株 副溶血弧菌GZ01由广东省湛江海域患病石斑鱼（Epinephelus coioides）鱼体中分离并保存。五味子、黄精购自湛江春天药房。

1.1.2主要仪器 -80℃超低温冰箱，青岛海尔公司产品；SZ-93自动双重双蒸水蒸馏器，上海市亚荣生化仪器厂产品；自动高压灭菌锅（HVE-50），日本HIRAYAMA公司产品；恒温培养箱为上海市博迅实业有限公司医疗设备厂产品；超净工作台，上海汇龙仪表电子有限责任公司生产；摇床，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；酶标仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.1.3药品及试剂配制 胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）：大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨15 g、NaCl 20 g，蒸馏水定容至1 000 mL（调节pH至7.2），高压灭菌，4℃保存。胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨15 g、琼脂粉15 g、NaCl 20 g，蒸馏水定容至1 000 mL（调节pH至7.2）。MTT 配制：0.5 g MTT，溶于 100 mL磷酸缓冲液（PBS），用 0.22 μm滤膜过滤除，4℃避光保存。PBS：Na2HPO41.44 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g，调节pH至7.4，定容至1 L。高压蒸汽灭菌，室温保存。0.85%生理盐水：NaCl 0.85 g，用蒸馏水定容至1 000 mL，高压锅灭菌后备用。

1.2试验方法

1.2.1副溶血弧菌培养 副溶血弧菌接种在含2%NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤培养液（TSB）中，28℃下120 r/min摇床培养18 h。用TSB将菌悬液的浓度调至约OD600=0.8备用（约108CFU/ mL）［12］。

1.2.2中草药水煎液的制备 中草药水煎液的制备参照黎家勤等［13］的方法。

1.2.3药物体外抑菌试验 采用琼脂扩散法。每种药液3次重复，分别向TSA平板加100 µL菌液，涂抹均匀。然后用打孔器在每个平板上打3个孔（每孔直径为6.00 mm，且两孔之间相距不小于2 cm），每孔加入30 µL药液。另设1个涂有副溶血弧菌菌液的平板作对照，将平板置于28℃培养24 h，观察抑菌效果并用游标卡尺测量抑菌圈。抑菌效果判定：抑菌圈直径≥20 mm为强抑菌作用，用“+++”表示；15～20 mm为中等抑菌作用，用“++”表示；10～15 mm为弱抑菌作用，“+”表示；≤10 mm为无抑菌作用，以“-”表示。

1.2.4MIC的测定 采用倍比稀释法确定最小抑菌浓度，参照冯锐基等［14］的方法。

1.2.5MBC的测定 在最小抑菌浓度的试管中取细菌生长不明显的试管，取100 µL分别涂布于TSA平板，于28℃培养24 h后观察结果。TSA平板上没有细菌生长且含药液浓度最低管的药液浓度，即为该种药物对溶藻弧菌的最小杀菌浓度［15］。

1.2.6副溶血弧菌生物膜的形成与定量检测生物膜活性测定：利用四甲基偶氮唑盐（MTT）法［15］测定生物膜活性，具体实验步骤参照黎家勤等的方法［13］。

1.2.7不同培养时间对副溶血弧菌成膜的影响将副溶血弧菌接种于96孔板后置于28℃湿盒中静止培养，每隔4～6 h取样，按1.2.6方法测定成膜情况。

1.2.8中草药液对副溶血弧菌生物膜形成的影响 在无菌条件下，将细菌悬浮液与TSB按1∶100的比例混合均匀，加入中草药水煎液，倍比稀释后，分别上样200 µL至96孔板中，每个处理设8个重复孔，并设置阳性对照（含0.1 mol/L EDTA）、阴性对照（含培养基和菌液）和仅含培养基的空白对照，28℃湿盒中培养12 h，按1.2.6步骤测定成膜情况。按以上方法设立无菌的药物对照。

用SPSS 17.0 软件中的成对样本t 检验进行数据统计分析。

2　结果与分析

2.1两种中草药对副溶血弧菌的抑菌效果

对五味子和黄精两种中草药体外抑菌试验结果（表1）表明，五味子对副溶血弧菌有中等抑菌作用，黄精有弱抑菌作用。

表1　五味子和黄精对副溶血弧菌的体外抑菌效果

2.2MIC和MBC测定结果

选用倍比稀释法测定五味子、黄精对副溶血弧菌的MIC和MBC，结果（表2）显示，五味子和黄精的抑菌效果一样，MIC和MBC分别为1.56、3.125 mg/mL。

表2　五味子和黄精对副溶血弧菌的MIC和MBC

2.3副溶血弧菌生物膜的生长曲线

用MTT法对生物膜进行定量检测，得到副溶血弧菌生物膜的生长曲线（图1），由图1可知，副溶血弧菌生物膜成膜量呈现先上升后下降的趋势。在12 h时OD590值达到最大，极显著高于其他时间的检测值。即在前12 h 中生物膜成膜量为逐渐增加，在12 h时形成的生物膜成膜量最大，12 h后又逐渐下降并出现再次上升现象，但均小于12 h时的成膜量。

图1　副溶血弧菌生物膜的生长曲线

2.4不同药物浓度对副溶血弧菌生物膜形成的影响

与阴性对照相比，五味子药物浓度在3.125mg/mL 以下时，虽对副溶血弧菌生物膜成膜量有所影响，但差异不显著，药物浓度为3.125 mg/ mL 时开始出现明显的抑制作用，药物浓度超过3.125 mg/mL时有极显著抑制作用（图2）。

图2　五味子对副溶血弧菌生物膜形成的影响

与阴性对照相比，黄精对副溶血弧菌生物膜成膜量的影响表现为：黄精煎液浓度在1.56 mg/mL及以下时，对副溶血弧菌生物膜成膜量有所影响，但差异不显著，药物浓度在3.125 mg/ mL及以上时，成膜量呈现极显著下降，即有极显著抑制作用（图3）。

图3　黄精对副溶血弧菌生物膜形成的影响

3　结论与讨论

目前，在海水养殖业持续发展中出现了各种致病性弧菌病，很大程度上影响了鱼、虾、蟹、贝等海产品的健康养殖，而针对各种弧菌病的防治普遍采用了抗生素和化学消毒剂，但它们对海水造成了污染，也使各种弧菌逐渐产生了抗药性。因此，寻找更安全、低污染的防治弧菌病的方法显得尤为重要。

中草药防治弧菌病的研究表明，五味子中的有机酸具有抑菌功能［16］。童国忠等［17］研究了中草药对海水养殖的大黄鱼病原哈氏弧菌的抑菌效果，结果表明五味子具有较好的抑菌效果。金珊等［18］通过15种中草药对鲈鱼体内分离的哈维氏弧菌等研究发现五味子具有一定的抑菌作用。郑天伦等［19］测定15 种中草药对大黄鱼病原菌——溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），其中五味子的抑菌能力最强。本研究探索了五味子对副溶血弧菌的体外抑菌作用，结果表明五味子对溶藻弧菌有中等抑菌作用，其抑菌圈直径为18.67（±0.2）mm，五味子对副溶血弧菌的MIC和MBC分别为1∶640和1∶320，这与童国忠等［15］“五味子对哈氏弧菌和副溶血弧菌的MIC和MBC均为1∶40”的结论存在一定差异。这可能是由于实验环境不同、中草药取材来源不同等引起的。五味子除了抑菌作用还能抑制生物膜的形成。当五味子药物浓度小于3.125 mg/mL 时对副溶血弧菌生物膜成膜量无显著抑制作用，当药液浓度达到3.125 mg/mL 以上时出现极显著抑制作用。

张传亮等［16］研究表明，富含多糖的黄精能通过调节机体免疫系统达到治疗弧菌病的效果。王玉娥等［20］发现黄精对哈氏弧菌和副溶血弧菌具有明显抑菌抗菌作用。赵明军等［21］通过中草药对水产动物疾病的防治效果研究中发现，黄精能在不同程度上缓解及治疗弧菌引起的鱼类疾病。本研究探索了黄精对副溶血弧菌的体外抑菌作用，结果表明黄精对副溶血弧菌的抑菌圈直径为11.26（±0.6）mm，MIC和MBC分别为1∶640和1∶320；当药物浓度达到3.125 mg/mL以上时，黄精对副溶血弧菌生物膜的形成有极显著抑制作用。

本试验结果表明，五味子和黄精对副溶血弧菌的游离菌及其生物膜形成具有抑制作用，对由致病性弧菌引起的水产动物疾病防治具有参考意义。但本研究只是在细菌相对稳定的生长环境中进行试验，没有考虑到环境和用药方式等对药效的影响，具有一定的局限性。此外，中草药制剂在海水动物细菌性疾病中的开发应用还处于摸索阶段，实际应用中仍存在一定问题，如由于季节、产地及炮制方法等不同造成同一种中草药的有效成分含量差异较大进而导致药材质量的不稳定［22］。今后，我们既要揭示渔用中草药的主要成分和功效，又要广泛开展养殖环境和用药方法上的综合研究，真正发挥中草药在海水养殖动物细菌性疾病防治中的重要作用。

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（责任编辑 杨贤智）

Inhibitory activity of Shisandra chinensis and Polygonatum sibiricum on Vibrio parahaemolyticus and its biomembrane

PANG Huan-ying ，HUANG Zhi-feng，HUANG Yang，HUANG Yu-cong，LU Yi-shan，JIAN Ji-chang
（Fisheries College of Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals/Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals，Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088，China）

The inhibitory effects of Shisandra chinensis and Polygonatum sibiricum on Vibrio parahaemolyticus were tested by disc agar diffusion，and the minimal inhibitory concentration（MIC） and minimal bactericidal concentration（MBC） were detected by double dilution；the effects of S. chinensis and P. sibiricum on V. parahaemolyticus biomembrane were measured by MTT assay. The two species of Chinese herbal medicine had different degree of inhibition. S. chinensis had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone（DIZ） of 18.67（±0.2） mm，and the MIC and MBC respectively were 1.56，3.125 mg/mL；P. sibiricum had inhibitory effects with the diameter of inhibition zone（DIZ） of 11.26（±0.6） mm，and the MIC and MBC respectively were 1.56，3.125 mg/mL. Both S. chinensis and P. sibiricum exhibited a potent inhibitory activity against V. parahaemolyticus biomembrane formation，when the concentration of medicine was over 3.125 mg/mL.

Shisandra chinensis；Polygonatum sibiricum；Vibrio parahaemolyticus；in vitro inhibitory activity；biomembrane

S948

A

1004-874X（2016）09-0119-05

2016-06-11

广东海洋大学创新强校项目（GDOU2015050216）；广东省教育厅基础研究重大培育项目（2014GKXM046）；广东高校国际合作创新平台项目（2013gjhz0008）

庞欢瑛（1980-），女，博士，副教授，E-mail：phying1218 @163.com

简纪常（1964-），男，博士，教授，E-mail：jianjc@gmail.com