刘泰瑜， 冯 豪， 张建国

上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200093



离心法分离毕赤酵母活细胞和死细胞

刘泰瑜， 冯 豪， 张建国*

上海理工大学食品科学与工程研究所，上海 200093

本文以毕赤酵母为研究对象，探索出一种分离活酵母细胞的新方法。研究发现，通过改变淋巴细胞分离液和50%聚蔗糖溶液的比例，获得不同密度的酵母细胞分离液，进而通过离心分层的方法可使毕赤酵母活细胞主要存留于离心液的上层。当酵母细胞分离液的密度为1.1467 g/mL(27.5% 淋巴细胞分离液+72.5%聚蔗糖溶液)，分离液上下层中酵母活细胞的分配比例差别达到最大，分别为94.67%(分离液上层)和5.33%(分离液下层)。毕赤酵母细胞浓度为4.35×108～1.13×109/mL时，活细胞在分离液上下两层的分配比例约为95%和5%。低毕赤酵母细胞存活率有利于离心分离。本方法可用于有效分离培养液中的毕赤酵母活细胞。

毕赤酵母； 离心； 死细胞； 分离细胞

毕赤酵母是一种能利用甲醇为碳源，且高效表达外源蛋白的工业微生物。毕赤酵母来源多种外源蛋白作为工业用酶和蛋白药物已经商业化[1]。所以越来越受到人们的重视[2-5]。毕赤酵母的优点总结为以下几个方面：1、高密度发酵，发酵过程中细胞干重达到130 g/L[6]。2、高效表达外源蛋白，外源蛋白在毕赤酵母中含量可高达35%[7]。3、重组后的毕赤酵母遗传稳定。4、毕赤酵母培养方法简便。

由于工业上的需要，筛选有更好性质的毕赤酵母是有必要的。亚硝基胍(NTG)诱变微生物的方法已经较为成熟，具有操作简单的优点[8]。NTG诱变过程需要连续诱变的步骤。通常的连续诱变是采用从前一个步骤中取一部分样品继续培养、诱变的重复操作。在这些重复操作步骤中，从前一步诱变的样品库中取出部分样品的步骤中就损失了前面几步诱变的细胞，降低了获得目的细胞的机率。所以，去掉取样的步骤，开发另外的方法去掉诱变后的死细胞，保存尽量多的诱变后活细胞，然后继续诱变，可以提高NTG诱变毕赤酵母的机率。密度梯度离心法已经成功用于分离哺乳动物细胞[9]。毕赤酵母死细胞会出现细胞器被液泡降解的现象，所以推断也会导致与毕赤酵母活细胞密度的不同。

本文摸索出一种新颖的聚蔗糖密度梯度离心方法，成功去除毕赤酵母培养液中的毕赤酵母死细胞。本方法可以应用到微生物连续诱变的操作中，尽量多的除去死细胞，保留活细胞，从而保证诱变效果的最大化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、试剂及培养基

毕赤酵母菌株GS115为本实验室保藏菌株。Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(密度1.077 g/mL)购自国药集团化学试剂有限公司。50%聚蔗糖溶液(密度1.173 g/mL)购自上海源叶生物科技有限公司。其它化学试剂购自国药化学试剂有限公司。YPD培养基(g/L)：酵母提取物10 g(Oxiod)、蛋白胨20 g(Oxiod)、葡萄糖20 g(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 毕赤酵母培养

在YPD培养基平板上将毕赤酵母菌株GS115进行划线分离，30℃下培养3d后挑取单菌落接入装有5 mL YPD培养基的20 mL试管中，在30 ℃、180 r/min下培养12 h。然后全部转接入装有100 mL YPD液体培养基的250 mL摇瓶中，在同条件下继续培养24 h。

1.2.2 酵母细胞分离液的配置

以不同比例混合淋巴细胞分离液和50%聚蔗糖溶液以获得不同密度的酵母细胞分离液。

1.2.3 总细胞数、活细胞数、活细胞比例的计算

每毫升培养液中毕赤酵母细胞总数采用血球计数法测定[10]。每毫升培养液中毕赤酵母活细胞数采用平板菌落计数法测定[11]。活细胞比例用公式1计算所得。

活细胞比例(%) =毕赤酵母活细胞数/毕赤酵母细胞总数×100

公式11.2.4 毕赤酵母细胞分离液密度对分离效果的影响

取0.1 mL菌液加入1.0 mL不同密度的聚蔗糖溶液中，在3 000 r/min下离心20 min。然后取分离液上层液体0.55 mL，转入已灭菌的1.5 mL离心管中，两管液体在震荡器上震荡10 S以混合均匀，然后分别计算每管中的毕赤酵母细胞总数和毕赤酵母活细胞数。

1.2.5 毕赤酵母细胞浓度对分离效果的影响

通过稀释方法获得一系列不同细胞浓度的毕赤酵母培养液。然后用同样方法进行分离操作，并分别计算上下层液体中的毕赤酵母细胞总数和毕赤酵母活细胞数。

1.2.6 毕赤酵母细胞存活率对分离效果的影响

分别取不同培养时间的毕赤酵母细胞培养液，利用稀释方法调整细胞浓度保持一致，同法进行密度梯度离心，然后分别计算上下层液体中的毕赤酵母细胞总数和活毕赤酵母细胞数。

2 结果

2.1 酵母细胞分离液密度对分离效果的影响

本研究中通过平板菌落计数法与血球计数板法测得24 h后酵母菌原液的存活率为78%，活细胞密度为9.25×108/mL。酵母细胞分离液的密度范围为1.1058g/mL～1.1538 g/mL。图1为采用不同密度的酵母细胞分离液对毕赤酵母细胞存活率的影响。酵母细胞分离液密度为1.1058 g/mL时，毕赤酵母细胞的存活率为5.82%。当酵母细胞分离液密度为1.1058 g/mL～1.1250 g/mL之间时，随着酵母细胞分离液密度的增大，细胞存活率也呈现增长的趋势。当酵母细胞分离液密度高于1.1250 g/mL时，酵母细胞存活率维持在40%左右。

图1 离心对毕赤酵母细胞存活率的影响

使用不同密度的酵母细胞分离液离心后，毕赤酵母活细胞在分离液上下层中的分配比例如图2所示。随着分离液密度增加，上层中酵母活细胞的比例由10.99%逐渐增大至92.80%，下层中活细胞的比例则由89.01%下降至7.20%。当分离液密度为1.1467 g/mL(27.5%淋巴细胞分离液+72.5%的聚蔗糖溶液)，上下层中活细胞分配比例差距达到最大，比例值分别为94.67%和5.33%。

图2 分离液密度对毕赤酵母活细胞在上下

2.2 酵母细胞浓度对活细胞在分离液上下层中分配的影响

当培养液中酵母细胞浓度在4.35×107～1.39×109/mL时，使用密度为1.1467 g/mL的酵母细胞分离液，酵母活细胞在分离液上下两层中的分配情况如图3所示。当酵母细胞浓度在4.35×108～1.13×109/mL的范围内，活细胞在分离液上下两层中的分配比例分别为95%和5%。

图3 毕赤酵母细胞浓度对活细胞在分离

2.3 酵母细胞存活率对分离效果的影响

毕赤酵母细胞浓度为1.2×109/mL，酵母存活率为11%时，活细胞在分离液上下层中的分配比例分别为91.01%和8.99%。随着酵母存活率的提高，分离液上下层中活细胞的分配比例差距逐渐缩小。当酵母细胞存活率为84.04%时，活细胞在分离液上下层中的分配比例分别为70.05%和29.55%。

图4 毕赤酵母细胞存活率对离心分离活

3 结论

毕赤酵母的应用前景越来越受到研究者的重视。毕赤酵母在工业生产中具有广泛的应用。毕赤酵母表达的蛋白包括蛋白药物[12]、工业用酶[13]、毕赤酵母作为模板改造外源蛋白糖基化，使外源蛋白的糖基化水平和结构和人源蛋白相同[14]。毕赤酵母的高密度培养方法也比较成熟[15]。但是毕赤酵母在高密度培养时一个不足就是死亡率高。毕赤酵母高密度培养过程中细胞死亡率达到35%[16]，限制了外源蛋白的表达[17]。所以，通过诱变的方式得到性能更好的毕赤酵母菌株是得到更高外源蛋白产量的一个途径。连续诱变的方法是一个有效但是繁琐的方法去诱变毕赤酵母，但是而且连续诱变操作中取样继续诱变的操作导致大部分上一步诱变细胞的丧失[18]。所以本研究中开发出一种简单的分离毕赤酵母活细胞和死细胞的方法，可以避免NTG诱变操作过程中连续取样导致的大量诱变后的毕赤酵母损失。

本文以毕赤酵母为研究对象，尝试开发一种新的分离酵母活细胞的方法。通过改变淋巴细胞分离液和50%聚蔗糖溶液的比例，获得了不同密度的酵母细胞分离液，并成功将毕赤酵母的活细胞和死细胞进行了分离。研究结果表明，毕赤酵母活细胞主要分布在分离液的上层。当酵母细胞分离液密度为1.1467 g/mL时，分离液上层中活细胞分配比例达94.67%。该种类型的酵母细胞分离液也能用于分离细胞浓度在4.35×108～1.13×109/mL的毕赤酵母细胞培养液样品。并且低毕赤酵母细胞存活率有利于离心分离的效果。采用离心分离法的依据是细胞比重的不同。而毕赤酵母细胞的凋亡可能会导致细胞密度的改变[19]。这可能是因为细胞死亡会导致细胞内蛋白质的积累[20]，从而导致死细胞和活细胞的密度有所差别。

目前探索出的分离方法尚不能100%分离活细胞，此外离心会造成至少60%的毕赤酵母细胞死亡。这些问题有待通过进一步的试验进行改进。

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Separation of alive and deadPichiapastoriscells by centrifugation

LIU Tai-yu, FENG Hao，ZHANG Jian-guo

Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, P.R.China

A new method of separating alivePichiapastoriscells from deadPichiapastoriscells using centrifugation approach was presented, in which alivePichiapastorisstayed in the up layer of centrifugation solution by changing the density of centrifugation solution through adjusting the ratio of Ficoll-Hypaque solution and 50% polysucrose solution. When the centrifugation method was carried out with thePichiapastoriscell density at 4.35×108/mL ～ 1.13×109/mL (27.5% of Ficoll-Hypaque solution and 72.5% of 50% polysucrose solution), it led to 95% and 5% alive stayed in up and down layer of centrifugation solution respectively, which was the highest proportion. And, low ratio of alivePichiapastoriscells provided higher distribution ratio of up layer centrifugation solution. In summary, this method effectively separate alivePichiapastorisfrom deadPichiapastoriscells.

Pichiapastoris; centrifugation; dead cells; alive cells

国家自然科学基金(No.21306112)；上海市自然科学基金资助项目(No.13ZR1429100)；上海高校青年教师培养资助计划(No.slg14037)；教育部留学回国人员科研启动基金。

刘泰瑜(1991～)，男，硕士研究生，主要从事微生物学研究。Tel：021-55803272，E-mail：757360730@qq.com。

*通讯作者: 张建国，男，副教授。Tel：021-55803272，E-mail：jgzhang@usst.edu.cn。