牵牛子不同提取物对小鼠急性毒性的比较研究
2016-11-10刘翠华何金洋
刘翠华 何金洋
(广州中医药大学热带医学研究所,广东 广州 510405)
牵牛子不同提取物对小鼠急性毒性的比较研究
刘翠华何金洋
(广州中医药大学热带医学研究所,广东 广州 510405)
目的:探讨中药牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物对小鼠急性毒性。方法:制备牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物,采用急性毒性替代法-上下法进行毒性比较。结果:牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物均不同程度表现出了急性毒性症状,按生药量计算的半数致死量(LD50)分别是455g/kg,32g/kg,9g/kg。结论:牵牛子不同提取物对小鼠的急性毒性强度为正丁醇部位>牵牛子氯仿部位>石油醚部位。
牵牛子;不同提取物;小鼠;急性毒性
牵牛子(学名:Pharbitisnil (Linn.) Choisy)为旋花科植物裂叶牵牛(Pharbitisnil L. Choisy) 或圆叶牵牛的干燥成熟种子,又名黑丑、白丑、二丑等。性寒,味苦;有毒,具有泻水、消痰涤饮、杀虫攻积等功效[1]。迄今为止,有关学者对牵牛的化学成分和药理作用等方面进行深入研究,发现牵牛子主要含有牵牛苷、生物碱类、糖类及蛋白质、甾醇类化合物、色素及脂肪油等[2-4];陈丽娜等[5]还发现了蒽醌、酚酸和二萜类有效成分。
牵牛子具有泻下及利尿,抑菌、兴奋子宫、抗肿瘤、抗高血脂等药理作用[6-11]。王燕等[12]报道牵牛子提取物对朱砂叶螨具有生物活性。李佳桓等[13]发现牵牛子酒提取物有对抗肿瘤抗转移作用。
现代对中药的毒性分级主要以半数致死量(LD50)为依据,分为大毒、有毒、小毒和无毒[14]。WHO颁布的化学物质的急性毒性分级标准为剧毒、高度、中毒、低毒和微毒[15]。牵牛子生用偏用于逐水消肿、杀虫。炮制后可降低毒性、缓和药性、免伤正气。
然而有关牵牛子提取物急性毒性和毒性症状研究报道却很少。前期笔者已筛选出牵牛子抗病毒中药提取物有效部位,本研究以昆明小鼠为实验对象,采用急性毒性替代法-上下法,测得牵牛子提取物的LD50值及95%可信区间,同时观察牵牛子不同提取物灌胃后的急性毒性反应,对牵牛子不同提取物进行毒性强度比较,进而为开展牵牛子亚急性、慢性毒性研究奠定基础,这是后期抗病毒中药复方研究必由之路。
1 实验材料
1.1实验药材
中药材牵牛子购自广州杏林春药房(20140625)。
1.2实验试剂
乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇均(广州化学试剂厂);3%苦味酸溶液(台山市众城化工有限公司);羧甲基纤维素钠溶液(天津市大茂化学试剂厂);0.9%生理盐水(天津市大茂化学试剂厂)。
1.3实验仪器
KQ-501E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HH6-型恒温水浴锅(江苏金坛市宏华仪器厂);R206旋转蒸发仪、R100旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);DLSB-30低温冷却液循环泵(郑州长盛仪器有限公司);TC-15套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂)。
2 实验动物
SPF级昆明小白鼠,雌性30只,雄性15只,体重18~22g,共35只,全部购于广东省广州中医药大学实验动物中心,于广州中医药大学实验动物中心SPF级实验室饲养。实验动物采用标准化笼子喂养,随机分组,每笼根据实验需求饲养3~5只以适应环境。本实验通过广州中医大学动物实验伦理委员会的审核[实验许可证号:SYXK(粤)2013-0001粤监证字00116824,严格按照动物实验有关规定进行。
3 实验方法
3.1供试样品的制备
中药材粉碎,以75%乙醇回流提取3次,每次2小时,合并乙醇提取液,真空抽滤,减压回收乙醇提取物,并挥发尽残余乙醇,得乙醇提取物浸膏。乙醇提取物用适当比例按有机溶剂极性大小:石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇,先后依次进行萃取,萃取至无色,分别减压回收萃取溶液,得所需中药材有效部位浸膏:石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位。
最终有效部位的萃取率分别是:牵牛子的石油醚部位0.83%,牵牛子氯仿部位0.99%,牵牛子正丁醇部位12%。
取适量牵牛子不同提取物用0.5%羧甲基纤维素钠溶液作为溶剂超声30min,配制成实验所需浓度。
3.2预实验
牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的小鼠急性毒性参照OECD TG25 UDP限度试验[16]进行预实验。
取雌性昆明小鼠3只,分别给与2000mg/kg剂量的牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物。给与牵牛子氯仿、正丁醇提取物小鼠死亡,可开始主试验,给与牵牛子石油醚提取物的昆明小鼠48h内未见死亡,顺序将2000mg/kg剂量牵牛子石油醚提取物给与2只小鼠,观察48h后3只均存活,可预测牵牛子石油醚提取物LD50≥2000mg/kg。再次取雌性昆明小鼠1只,分别给与5000mg/kg剂量的牵牛子石油醚提取物,小鼠12h内死亡,解剖可见脏器有颜色改变,失禁,大便稀软,可预测牵牛子石油醚提取物的LD50≤5000mg/kg,即牵牛子石油醚提取物的LD50在2000mg/kg到5000mg/kg之间。
3.3主试验(正式试验)
牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的急性毒性参照OECD TG25 UDP[16]进行。
全部使用雌性昆明小鼠,默认剂量级数因子3.2(斜率为2.0)。牵牛子氯仿、正丁醇提取物按剂量1.75、5.5、17.5、55、 175、550、2000mg/kg贯序进行,牵牛子石油醚提取物按剂量1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg)贯序进行,三种提取物起始剂量均从175 mg/kg开始。每次按顺序给药1只老鼠,观察48h,若存活,则提高一级剂量,再次观察48h;若死亡,则降低一级剂量,每次给与剂量后可将动物结局输入AOT425StatPgm程序[16]中,软件自动给出下次给与剂量大小,直到出现终止试验的剂量,软件将估算出LD50值和其95%的可信区间。试验期间,每次给药后,及时观察记录小鼠的毒性表现,包括呼吸、运动功能、毛发、对外反应,瞳孔大小,分泌物和排泄物以及小鼠的死亡等情况。
4 结果
牵牛子石油醚提取物给药剂量5000mg/kg后观察,反应迟钝,毛发杂乱,嗜睡,眯眼,唾液分泌较多,眼内湿润,有清稀分泌物,口周毛潮湿,笼内有呕吐物,肛门周围毛潮湿,粪便稀且呈褐绿色,12h内死亡。该毒性表现可能提示牵牛子石油醚提取物在此剂量时对睡眠中枢,中枢神经系统、感官、神经肌肉,自主神经系统,胃肠动力、肾脏均有毒性作用。解剖未见内脏颜色,大小变化,胃内容物为油黄色,是溶剂玉米油颜色。给药剂量1750mg/kg,给药后2h内,毛发稍显毛糙,眯眼,稍困倦,肛门周围潮湿,触摸有反应,有惊跳反射,在存活/死亡之间转换。175 mg/kg 、550 mg/kg剂量,除给药第一天进食稍微减少,存活14天以上,肉眼未见明显毒性表现。该提取物动物结局和LD50值,如表1所示。
牵牛子氯仿提取物给药剂量2000mg/kg,给药后,喘息,困倦,俯卧,呕吐,后出现躁动,行动时颤抖,水样便,1h内死亡。该毒性表现可能提示牵牛子氯仿提取物在此剂量时对呼吸中枢,睡眠中枢,自主神经系统,中枢神经系统、神经肌肉有毒性作用。550 mg/kg剂量,给药后,反应慢。俯卧,困倦,笼内大便湿润,前肢抽搐死亡,在12h内死亡,该毒性表现可能提示牵牛子氯仿提取物仍对睡眠中枢,自主神经系统,中枢神经系统、神经肌肉有毒性作用。解剖未见内脏颜色,大小变化,内脏较湿润,胃内容物为油黄色,是溶剂玉米油颜色。175 mg/kg剂量,粪便稍湿润,反应灵敏,进食进水正常,未见明显毒性症状。该提取物动物结局和LD50值,如表1所示。
牵牛子正丁醇提取物给药剂量2000mg/kg,给药后,反应迟钝,眯眼困倦,腹式呼吸明显,大便较湿润,渐渐无力,动作不协调,失禁,12h内死亡。该毒性表现牵牛子正丁醇提取物在此剂量可能对睡眠中枢,呼吸中枢,感官系统、神经肌肉系统乃至胃肠道系统有毒性作用。解剖可见胃部饱胀,内脏稍湿润偏红,肝脏、胃底部,小肠颜色偏深红,提示牵牛子正丁醇提取物对整个内脏系统均有毒性。550 mg/kg和175 mg/kg,给药后几天内,饮食量相对减少,困倦,反应稍慢,毛发稍无光泽,经过14天观察后,反应灵敏,肉眼未见明显的包括呼吸、运动功能、毛发、对外反应,瞳孔大小,分泌物和排泄物等表现异常。该提取物动物结局和LD50值,如表1所示。
表1 牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的急性毒性上下法(UDP)试验结果
5 讨论
现代药理实验证明牵牛子对人体有毒,牵牛子服用不当,出现呕吐、腹痛、腹泻、大便有粘液和血、甚至昏迷等。急性毒性试验是评价药物安全的第一环节,获取药物毒性资料能更好指导下一步的实验。
本文对牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物进行急性毒性比较研究,发现灌胃牵牛子不同提取物后均有一定急性毒性症状,以生药计,牵牛子石油醚、氯仿、正丁醇提取物的按生药量计算的半数致死量分别是455g/kg,32g/kg,9g/kg,表明3种提取物对小鼠的急性毒性强度:牵牛子氯仿部位>牵牛子正丁醇部位>牵牛子石油醚部位。对牵牛子不同提取物进行急性毒性强度比较,进而为开展牵牛子提取物的亚急性、慢性毒性研究奠定基础,为药用提取物的的开发提供安全性评价基础,这是后期抗病毒中药复方研究必由之路。
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Comparative study on mice's acute toxicity of different composition in Prepared Pharbitis nil
Objective: Objective to study of the acute toxicity of Petroleum etherextract, chloroform extract, N-butanol extracts of the traditional Chinese Pharbitis nil choisy. Methods: Prepared Pharbitis nil choisy Petroleum ether extract, chloroform extract, N-butanol extract. To compare the acute toxicity of different components in accordance with up and down procedure(UDP) of alternative methods for acute oral toxicity testing. Results: Petroleum ether extract, chloroform extract and N-butanol extract of Pharbitis nil choisy showed obvious symptoms of acute toxicity in different extent. According to calculation of crude drugs,median lethal dose (LD50)respectively of three kinds of extracts was 455 g/kg, 32 g/kg, 9 g/kg. Conclusion :the acute toxicity of three kinds of extracts of Pharbitis nil choisy in mice was chloroform extract >N-butanol extract>Petroleum ether extract.
Pharbitis nil choisy; different extracts; mice; acute toxicity
R282;R285.5
A
1008-1151(2016)03-0073-03
2016-02-10
国家自然科学基金面上项目(8117325,81573861)。
刘翠华(1988-),女,广州中医药大学热带医学研究所硕士研究生,研究方向为中医治疗艾滋病。
何金洋(1975-),男,广东广州人,广州中医药大学热带医学研究所研究员,研究方向为中医治疗艾滋病。