丛 赢 张 琳 祖元刚 杨 磊 昝 鹏

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum)精油的抗炎及抗氧化活性初步研究

丛 赢 张 琳*祖元刚 杨 磊 昝 鹏

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

通过MTT检验和NO含量测定，观察油樟精油对LPS致炎RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用；通过角叉菜胶足肿胀致炎模型检测油樟精油的体内抗炎活性；并采用DPPH·自由基清除能力检测油樟精油的抗氧化能力。结果表明：油樟精油能够降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞致炎模型的细胞抑制率并减少模型细胞一氧化氮(NO)产量；对角叉菜胶所致大鼠足肿胀有减缓效果且呈剂量依赖性；能够使DPPH·自由基清除率显著增加，并随时间延长效果更显著。表明油樟精油具有一定的抗炎及抗氧化活性。

油樟；精油；抗氧化；抗炎

油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N.Chao ex H.W.Li)，为我国特有的樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)树种，其叶、枝、根、花和果等部位均富含芳香精油，我国每年油樟精油产量达世界总产量的46%。油樟具有多种药理活性，有研究表明油樟提取物将人肝癌BEL-7402细胞分裂阻滞于G0/G1期和S期,阻断肝癌细胞分裂增殖并能够诱导BEL-7403细胞发生凋亡，凋亡率随时间延长而增大[1]；油樟叶多糖具有抗油脂氧化作用[2]；另外，油樟具有抗炎活性，其对足底福尔马林诱导的化学伤害和醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增加都有抑制效果[3]；油樟叶还具有镇痛抑菌等作用[4]。目前，油樟被应用于日化、香料、医药和食品工业等生活领域[5]。

大量临床研究显示，炎症和氧化应激与多种常见疾病密切相关并参与其发生发展过程，如脑梗、动脉粥样硬化、糖尿病、肺炎、肥胖哮喘、子痫前期等疾病[6～13]。炎症是很多疾病的重要病理过程，在此过程中，炎症介质的过剩分泌会引发机体不同程度的功能性障碍，诱导心血管等疾病的发生[14～15]；氧化应激是自由基攻击蛋白大分子导致的酶立体构象改变、膜脂流失、核酸损毁，引起食物腐变、生物机体打乱自身代谢平衡、衰老加剧并且降低人体免疫力诱发癌症与肿瘤的反应[16～17]。目前常用的甾体/非甾体类抗炎药物及人工合成抗氧化剂，具有一定的致癌和毒副作用，易侵害人体免疫系统，诱发骨质疏松、消化系统溃疡等[18]。植物源性天然活性物质对人体具有副作用少、毒性小、不易产生耐药性等优点，已然成为当今医药研究方向的主流。综上所述，本文拟对油樟精油抗氧化活性和细胞水平上的抗炎活性进行研究，为油樟精油的合理开发利用及寻找高效低毒的天然抗氧化剂及高效低副作用的天然抗炎活性成分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

油樟鲜叶采集自四川宜宾，低温烘干后室温保存，待用；PBS缓冲液配制：依次称取NaCl 4 g，KCl 0.1 g，Na2HPO40.72 g，KH2PO40.12 g加入适量蒸馏水使其完全溶解，调节pH=7.4后蒸馏水定容至500 mL，灭菌后4℃冰箱保存备用；RAW264.7巨噬细胞中国细胞库典藏细胞中心购买；1，1-二苯-2-苦基肼(DPPH·)购于阿拉丁公司；脂多糖(LPS)购置于美国Sigma公司；实验动物为昆明种大鼠，体重160±10 g，由哈尔滨医科大学附属肿瘤医院实验动物中心购买；MTT和NO试剂盒分别购于美国Sigma公司和Griess公司。

1.2 油樟精油的提取

取低温烘干后粉碎的油樟叶片100 g放入2 000 mL蒸馏烧瓶中，按料液比1∶10加入蒸馏水，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，沸腾后提取120 min，冷却至室温，取上层加入无水硫酸钠脱水得油樟精油。将精油装入密封的精油瓶中，4℃保存，待用。

1.3 气相—质谱(GC-MS)分析油樟精油成分

采用安捷伦7000A三重四极杆串联气质联用仪(GC-MS)对油樟精油化学成分进行分析。气相条件：色谱柱为石英毛细管柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度280℃，柱温50℃保持2 min，以3℃/min升至180℃，保持2 min，再以8℃/min升至240℃保持5 min，共运行60 min，载气He，流速1.0 mL·min-1，进样量1 μL，分流比20∶1。质谱条件：EI离子源温度180℃，接口温度：260℃，扫描范围(m/z)50～620。

1.4 RAW264.7巨噬细胞常规培养

将冻存的RAW264.7细胞置于37～43℃水浴中，充分摇动使其在30 s至1分钟内急速融化，将细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入DMEM低糖培养基，将培养瓶置于细胞培养箱中，于37℃，5% CO2条件下培养，每1～2天传代1次,取对数生长期的细胞进行实验。

1.5 LPS诱导RAW264.7细胞致炎

将常规培养对数生长期的RAW264.7巨噬细胞反复吹打成单细胞悬液后移入96孔板中，调整细胞密度为1.0×104个/mL，每孔内细胞与培养基的体积定容为100 μL。将细胞板置于37℃，5% CO2条件下培养24 h，加入LPS使每孔内终浓度为1 μg·mL-1，继续培养24 h后弃去培养基，用灭菌后的PBS缓冲液清洗2次，每孔加100 μL油樟精油浓度为10，50，100 μg·mL-1的细胞培养液，空白对照为100 μL正常细胞培养液，阳性对照加入100 μL用培养液配置的浓度为200 μg·mL-1的地塞米松，继续培养24 h。每组设6个复孔。

1.6 MTT比色实验

称取0.5 g MTT粉末溶于100 mL灭菌的PBS缓冲液中，用0.22 μm滤膜过滤后铝箔纸包裹含MTT液容器，避光保存。

按照1.5方法处理的细胞，每孔中加入20 μL上述配置的MTT溶液，孵育4 h后弃去上清，每孔中加100 μL二甲基亚砜(DMSO)水平震荡10 min，待紫色结晶完全溶解，酶标仪检测490 nm处吸光度值(A)并计算细胞相对抑制率。计算公式如下：

(1)

式中：A为实验组OD平均值；A0为空白对照组OD平均值；A1为阳性对照组OD平均值。

1.7 对RAW264.7细胞分泌NO含量的测定

采用Griess试剂盒对RAW264.7巨噬细胞分泌的NO进行含量测定。用去离子水将6.9 mg的NaNO2溶解，并定容至10 mL，得到10 mol·L-1的NaNO2溶液。将此溶液用去离子水稀释为：80、40、20、10、5、2.5 μmol·L-1，取不同浓度的标准溶液各100 μL，加入相应的96孔板中，每孔加入50 μL Griess试剂A混合均匀，室温下避光静置5 min，再向各孔加50 μL试剂B，室温避光条件下静置10 min后，酶标仪540 nm波长处检测各孔吸光度值，空白为去离子水，每组6个复孔。并以吸光度值为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标，绘制NO标准曲线。

按照1.5处理方法得到的细胞离心1 000 r·min-115 min，根据试剂盒方法检测各孔吸光度值(A)，根据NO标准曲线计算各组NO浓度。

1.8 油樟精油抗炎活性体内检测

160±10 g清洁级昆明种大鼠36只，随机分6组(n=6)，雌雄各半，分别为空白对照组、油樟精油高剂量组、油樟精油中剂量组、油樟精油低剂量组、阳性对照组、模型对照组，以地塞米松为阳性对照组，溶剂为模型对照组。地塞米松按2 mg·kg-1，油樟精油高、中、低剂量组按10、5、2.5 mg·kg-1·bw，连续灌胃4天，末次灌胃后30 min，在每只鼠的左足趾皮下注射1%的角叉菜胶0.3 mL致炎。分别测量致炎前和致炎后0.5、1、2、4、6、8、12 h的足周长，并根据公式计算肿胀度。

(2)

1.9 油樟精油的抗氧化活性研究

DPPH·自由基清除能力检测采用Ardestani的方法进行[19]，精密称取2.5 mg DPPH·置于100 mL容量瓶中加乙醇定容，配制成浓度为25 μg·mL-1的储备液，用储备液配成浓度分别为2.5、5、10、15、20 μg·mL-1的标准溶液,分别测定其516 nm波长处的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

油樟精油样品用无水乙醇配制成不同浓度梯度的待测液，分别为0.02、0.039、0.078、0.156、0.314、

0.625、1.25、2.5、5、10 mg·mL-1，同时以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，分别取0.1 mL测试液与3.9 mL浓度为0.1 mmol·L-1DPPH·无水乙醇溶液混合均匀，室温下避光反应30和60 min后于516 nm下测定吸光值，以无水乙醇为空白样，平行测定3次，取平均值。自由基清除率按下式计算:

(3)

式中：A0为不加样品的DPPH·溶液吸光度值；At为待测样品与DPPH·反应t时间处的吸光度值。

1.10 统计学分析

采用SPSS17.0进行数据统计分析，计量资料以DUNCAN检测，组间比对采用ANOVA检验，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 油樟精油GC-MS结果分析

根据油樟精油的GC-MS条件，对提取得到的油樟精油进行成分分析。图1为油樟精油的总离子流图。每个色谱峰相对应的质谱图经Nist标准质谱库检索和人工解析，并通过查阅文献确定了28种精油的化学成分。同时，每个成分的相对比例与峰面积用归一法进行计算，得到精油组分定性定量结果如表1所示。

从表1可以看出，精油成分中含量大于1%的主要成分分有12种，分别为3-蒈烯、β-水芹烯、萜品油烯、乙酸异龙脑酯、α-松油烯、β-桉叶油醇、乙酸-4-松油烯醇、α-松油醇、松油醇、乙酸松油酯、α-石竹烯、β-葎草烯，采用峰面积归一法计算出所含成分的相对百分含量，精油中大于1% 的主要成分占精油总含量的92.94%。精油成分中大于10%的主要成分为：β-桉叶油醇和乙酸松油酯，占总含量的57.36%。

图1 油樟精油的总离子流图Fig.1 The total ion chromatography of C.longepaniculatum essential oil

Table1ChemicalcompositionandcontentofC.longepaniculatumessentialoil

编号No．成分名称Compoundname分子式Molecularformula相对含量Relativecontent(%)1α⁃水芹烯α⁃PhellandreneC10H160．9823⁃蒈烯3⁃CareneC10H164．793β⁃水芹烯β⁃PhellandreneC10H1610．694萜品油烯TerpinoleneC10H162．735乙酸异龙脑酯LavandulylacetateC12H20O21．56γ⁃松油烯γ⁃TerpineneC10H160．117α⁃松油烯α⁃TerpineneC10H161．78对伞花烃p⁃CymeneC10H140．1994⁃亚甲基⁃1⁃(1⁃甲基乙基)环己烯Cyclohexene，4⁃methylene⁃1⁃(1⁃methylethyl)C10H160．8510β⁃桉叶油醇β⁃EudesmolC10H18O37．8911β⁃罗勒烯β⁃OcimeneC10H160．0512乙酸⁃4⁃松油烯醇酯4⁃TerpinenylacetateC12H20O22．8313萜烯醇Terpinen⁃4⁃olC10H18O0．19142⁃蒈烯2⁃CareneC10H160．6915芳樟醇LinaloolC10H18O0．1616异丁酸芳樟酯LinalylisobutyrateC14H24O20．0517莰烯CampheneC10H160．2618侧柏醇ThujylalcoholC10H18O0．1719α⁃松油醇α⁃TerpineolC10H18O1．6920松油醇Terpineol⁃4C10H18O5．6721乙酸松油酯TerpinylacetateC12H20O219．4722γ⁃榄香烯γ⁃ElemeneC15H240．1623β⁃榄香烯β⁃ElemeneC15H240．124α⁃石竹烯α⁃CarophylleneC15H241．0425毕澄茄烯CubebeneC15H240．2426β⁃葎草烯β⁃HumuleneC15H242．9427异长叶烯IsolongifoleneC21H32O20．2628愈创木醇GuaiolC15H26O0．26

2.2MTT法测定油樟精油对RAW264.7细胞生长的影响

MTT作为外源性物质进入巨噬细胞，线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将该外源性物质还原为沉积在细胞中的紫色不溶颗粒[21～22]。而形成的紫色颗粒状不溶物的生成量与活细胞数目正相关，DMSO可溶解这些紫色颗粒，测定吸光度值计算其细胞相对抑制率。在图2中可看出在10～100 μg·mL-1浓度范围内，LPS模型组与未添加精油正常培养的RAW264.7巨噬细胞的空白对照组相较细胞的相对抑制率明显增加，故LPS造模成功。表明油樟精油可刺激细胞活化增殖，诱导致炎状态的巨噬细胞存活状态趋向正常状态，增强在致炎过程中减弱的细胞功能，提高机体的免疫能力。

图2 不同浓度油樟精油对RAW264.7细胞生长的影响Fig.2 Effect of different concentrations of C.longepaniculatum essential oil of RAW264.7 cells growth

2.3 油樟精油对RAW264.7细胞分泌NO的影响

NO是动物体内极强的自由基，可起到神经递质作用。同时又参与学习与记忆、抑制血小板聚集、使血管平滑肌变松弛，并调节免疫系统，是一种重要的信号因子[22]。正常生理情况下细胞仅产生少量NO，炎症细胞中过量的NO能够转变成硝酸根离子产生细胞毒性，造成细胞病理损伤。实验中可以依据检测硝酸根无机盐浓度间接测定NO，其主要原理是NO在有水与氧的环境下生成亚硝酸盐和硝酸盐，这两类无机盐可与硝酸盐显色剂生成淡红色的偶氮化合物，继而推断细胞释放NO的水平，进而评价油樟精油在细胞内的抗炎活性。NO标准曲线的回归方程为Y=0.025 1X+0.077 7(R2=0.999 5)，表明在2.5～80 μmol·L-1浓度范围内线性关系良好。

油樟精油对RAW264.7巨噬细胞分泌NO的影响见图3。常规培养的RAW264.7巨噬细胞被浓度为1 μg·mL-1的LPS刺激24 h后，细胞上清中释放NO的量显著增加，与正常RAW264.7巨噬细胞的空白对照组相较差异具有统计学意义(P<0.01)，表明LPS诱导RAW264.7巨噬细胞释放NO的炎症模型建立成功。LPS与不同浓度的油樟精油同时作用于细胞时，LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放NO的量均显著降低，并且呈量效关系。与LPS组相较，地塞米松阳性对照组和油樟精油高、中、低剂量组对NO的分泌均有抑制作用(P<0.01)。在精油浓度为10 μg·mL-1时的抑制作用比地塞米松组略低，油樟精油浓度大于50 μg·mL-1时对NO的抑制作用显著强于地塞米松阳性对照组(P<0.01)，通过计算NO半抑制浓度IC50，可知油樟精油对NO抑制作用的IC50小于100 μg·mL-1，表明油樟精油抑制NO作用良好，具有一定的抗炎活性。

图3 油樟精油对细胞释放NO的影响Fig.3 Effect of C.longepaniculatum essential oil on cells release NO

2.4油樟精油对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度的影响

实验动物种系纯和，抗感染能力能力强，一般不会因常规操作而引起伤口继发性感染，足趾皮下注射角叉菜胶可使大鼠足爪致炎而肿胀，为非特异性炎症动物疾病模型。由图4可见，大鼠足趾注射角叉菜胶在0.5～12 h内，模型对照组的肿胀度最高，与之相较地塞米松阳性对照组肿胀度显著降低(P<0.01)，油樟精油高剂量组(10 mg·kg-1·bw)、中剂量组(5 mg·kg-1·bw)、低剂量组(2.5 mg·kg-1·bw)都可降低致炎肿胀度并且效果显著，高剂量组与地塞米松阳性对照组效果基本相当。由此可见，油樟精油的体内抗炎活性良好。

2.5 油樟精油抗氧化活性分析

DPPH·是人工合成的非常稳定一种自由基，该检测体系是抗氧化剂可与自由基单电子配对，使其在516 nm处吸光度值的变化与接受电子数成定量关系，因而通过检测待测物对DPPH·自由基的清除能力即可表示其抗氧化活性的强弱。DPPH·标准曲线的回归方程为Y=0.008 2X+0.064 5，R2=0.999 1，表明在2.5～25 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。油樟精油清除DPPH·自由基能力见图5。

图4 油樟精油对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀度的影响Fig.4 Effect of C.longepaniculatum essential oil on edema of rat hind paw induced by carrageenan

图5 油樟精油对DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effect of DPPH· with C.longepaniculatum essential oil

由图5可以看出，与Vc阳性对照组相较，油樟精油具有一定的清除DPPH·的能力，两者在各受试浓度下的清除率之间存在明显差异(P<0.05)。油樟精油的自由基清除能力与时间和浓度均相关，浓度升高与反应时间延长都会使油樟精油的自由基清除率增强。

3 讨论

本研究通过GC-MS法对油樟精油化学成分进行分析，检测出28种化合物，其中主要成分为β-桉叶油醇和乙酸松油酯，占总含量的57.36%。本文对油樟精油抗炎活性及抗氧化进行了初步研究，并证明了油樟精油的自由基清除能力与时间和浓度的相关性，浓度升高与反应时间延长都会增强油樟精油的自由基清除能力。油樟精油对DPPH·自由基的清除能力良好，说明其抗氧化活性较强。炎症是机体抗炎症介质损伤的免疫应答反应，各组织和器官均可发生，为常见的临床病理过程，可依据病程经过分为急性和慢性两类。角叉菜胶可引起大鼠足爪急性炎症反应，表现为毛细血管扩张及其透性升高，炎性渗出加速使血管内液体成分和炎症细胞进入足部组织中引起大鼠足爪局部肿胀。本文通过对LPS致炎RAW264.7巨噬细胞的MTT检验和NO含量检测，可发现油樟精油具有一定的抗炎活性。油樟精油低、中、高剂量组对角叉菜胶导致的大鼠足爪肿胀均有不同程度抑制作用并可改善组织水肿，可见油樟精油具有一定的抗急性炎症作用。本研究为合理且有效地开发油樟精油提供了科学理论依据。

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Special Fund for Forestry Scientific Research in the Public Interest(20140460202)

introduction：CONG Ying(1990—),female,master,specializing in research and utilization of plant resources.

date:2016-06-04

Anti-inflammatoryandAntioxidantActivityofCinnamomumlongepaniculatumEssentialOil

CONG Ying ZHANG Lin*ZU Yuan-Gang YANG Lei ZAN Peng

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

Anti-inflammatory effect ofCinnamomumlongepaniculatumessential oil on LPS-induced RAW264.7 macrophages inflammation was observed by MTT test and the content of NO. In vivo, anti-inflammatory activity was carried by checking carrageenan-induced rat paw swelling degree treated withC.longepaniculatumessential oil. The antioxidant capacity was determined by measuring DPPH·radical scavenging ability.C.longepaniculatumessential oil can reduce the inhibition rate and NO production of the LPS-induced RAW264.7 macrophage and it can also reduce carrageenan-induced rat paw swelling with dose-dependent manner.C.longepaniculatumessential oil can induce DPPH radical scavenging rate increased significantly, and the effect is more significant with time. Therefore,C.longepaniculatumoil has anti-inflammatory and anti-oxidant activity.

Cinnamomumlongepaniculatum;essential oil;anti-inflammatory activity;antioxidant activity

公益性行业科研专项经费项目(20140460202)

丛赢(1990—)，女，硕士研究生，主要从事植物资源开发与利用。

* 通信作者：E-mail：zhanglin6600@sina.com

2016-06-04

* Corresponding author：E-mail：zhanglin6600@sina.com

S792.23

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.020