宋文利，郑建明，莫春柏，冯刚（天津市第一中心医院器官移植中心，天津 300192）

移植免疫学的发展和外科技术的成熟，使器官移植从梦想变成了现实，并已成为一门体现医院综合实力的新型学科。肾移植作为器官移植的代表，是治疗终末期肾病的有效措施[1]。我国的肾移植发展更为迅速。肾移植术后1年的移植物存活率不断提高，但长期（10年）存活率却停滞在10年前的水平[2]。

尽管各种新型免疫抑制剂的应用使人、肾存活率得到了很大程度的提高，但移植排斥反应仍然是器官移植所面临的主要障碍。急性排斥反应（AR）是最为常见的排斥反应，约35%的肾移植受者在移植后1年内发生过AR[3]。AR也是导致慢性排斥反应（CR）发生的一个重要危险因素[4]。因此，AR的早期诊断及干预，对移植肾功能的恢复至关重要。尽管移植肾活检仍然是移植肾排斥诊断的金标准[5]，但受穿刺活检有创性检查及患者意愿的限制，更愿意接受非侵袭性的诊断方法，细胞因子在器官移植AR的发生和发展中的作用受到了广泛的重视和深入的研究。

移植肾活检标本的基因研究表明，细胞因子、趋化因子、信使核糖核酸等标记物在移植肾失功的诊断中扮演重要角色[6]。移植物进入机体后其人类白细胞抗原（HLA）致敏机体免疫细胞，激活的免疫细胞通过识别移植物细胞，产生白细胞介素（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10）、γ- 干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）等多种细胞因子，引起免疫排斥反应，而细胞因子常常在排斥反应早期即被释放，因此，可以作为排斥反应的早期诊断指标。研究表明，采用基因表达谱芯片能够研究大鼠肝移植后发生AR时T淋巴细胞作用的分子机制[7]。

基因芯片技术作为一种工具，是指在固相支持物上将大量DNA探针以微阵列的方式固化，具有高通量的特点，为解析肾移植中复杂的基因调控网络提供了一项崭新的技术手段。

1 资料与方法

1.1 样本资料选择：选取天津市第一中心医院实施的同种异体肾移植术712例，对可能具有良好依从性及门诊能追踪随访的217例患者，于肾移植术当日（术前）取10 ml外周血作为随访血样库，其中发生AR确诊的患者在移植肾穿刺活检的当日（治疗前）取10 ml外周血作为实验血样，以其在随访血样库中的血样作为对照样本。本研究符合医学伦理学标准，经医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。所有入选的患者按病例编号。

1.2 样本资料处理：所有血样均采用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。淋巴细胞分离：在无菌条件下采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核淋巴细胞，用无RNA酶的PBS清洗细胞，并回收细胞，置于液氮中保存。

总RNA提取：采用Trizol试剂提取总RNA，加入RNase-free H2O完全溶解RNA，以电泳和吸光度值进行检测验证，将总RNA在-80℃中保存。

探针标记：反转录合成cDNA，使用随机引物标记试剂盒，Cy3标记术前样品，Cy5标记肾穿刺当日样品。

1.3 基因芯片：选择本实验平台前期提供的基因芯片，由转化生长因子（TGF-β）、α-干扰素（IFN-α）、IL-10、受激活调节正常细胞表达和分泌因子（RANTES）、白细胞介素（IL-2、IL-7，IL-10、IL-15、IL-4、IL-8），Fas配体，穿孔素，颗粒酶B、IFN-γ等475个基因构建，通过BLAST比对特异序列片断，根据实验预定的分辨度范围设计探针。芯片杂交：取30 μl杂交混和液 （PCR产物，100 μg/ml鲑精 DNA，2×SSC，1%SDS，ddH2O）覆盖片基上点好的矩阵区域，加放盖玻片。保湿条件下杂交盒中置于杂交舱40℃放置2小时。

1.4 数据分析：基因芯片技术可以同时检测上万个基因的表达水平，然而从样本准备到数据处理的过程中每一步都可能导致误差和偏移，标准化可以调整标记效率的差异和不同芯片上荧光强度的差别。

1.4.1 线性标准化：设R为Cy5的荧光强度值，G为Cy3的荧光强度值，A＝1/2Log2（RG）。理论上所有点都应该满足下面的方程：M＝b0 + b1A，根据最小二乘法的原理计算出直线方程，并对每个点进行校正。

1.4.2 不同芯片的整体标准化：假设Cy3或Cy5的荧光强度为P，M＝Log2（P），α为M的中位数。理论上所有芯片上的Cy3或Cy5的α都应该相等，取所有α值的中位数来对所有的Cy3和Cy5的荧光强度值进行标准化。

1.4.3 共同差异基因的筛选：计算线性标准化后Cy5或Cy3的比值为Ratio值，Ratio值＞1.5或＜0.67为1.5倍差异表达基因。

1.4.4 差异基因功能：用GoMiner软件分析共同差异表达基因的功能。

2 结 果

2.1 总RNA提取（图1）：从淋巴细胞中提取总RNA，电泳结果显示18 s和28 s条带清晰，对照样品和实验样品的OD260/OD280值均大于1.90。

2.2 杂交后芯片扫描（图2）：芯片杂交后检测荧光信号，Cy3/Cy5激发后的荧光可以被ScanArry GX基因芯片扫描仪捕获。

图1 总RNA电泳图

图2 杂交芯片扫描结果（a：Cy3标记，b：Cy5标记）

2.3 排异组差异基因：计算线性标准化后Cy5或Cy3的比值为Ratio值，Ratio值＞1.5或Ratio值＜0.67为1.5倍差异表达基因。Ratio值＞1.5的上调表达基因为20个（表1），Ratio值＜0.67的下调表达基因为11个（表2）。

表1 排异组上调基因（±s）

表1 排异组上调基因（±s）

编号 基因 Raito值1 IL-4 3.368±1.225 2 IL-6 4.528±1.078 3 IL-10 3.456±0.896 4 IL-2 2.980±1.098 5 IL-15 1.987±0.556 6 INF-γ 2.445±0.034 7 TNF-α 2.887±0.226 8 CD126 2.980±0.336 9 CTLA-4 3.123±1.445 10 IL-5 2.776±1.036 11 IL-13 1.678±0.047 12 IL-18 2.128±0.365 13 CD40L 4.187±1.479 14 Perforin 2.567±1.086 15 Granzyme B 2.433±0.556 16 FasL 4.067±2.765 17 MCP1 1.789±0.331 18 CD30 4.356±2.656 19 HLA-DR 3.677±1.032 20 MIP-1 2.045±0.089

表2 排异组下调基因（±s）

表2 排异组下调基因（±s）

编号 基因 Ratio 1 TGF-β 0.485±0.035 2 RAB5C 0.297±0.218 3 RAB6C 0.452±0.104 4 RAB10 0.360±0.071 5 IL-17 0.344±0.025 6 IL-12 0.356±0.008 7 CD4 0.298±0.165 8 CD47 0.378±0.088 9 CD24 0.229±0.122 10 CD79B 0.388±0.104 11 CD81 0.412±0.036

3 讨 论

同种异体肾移植所致AR的发生，主要是由抗原识别，淋巴细胞的增殖、分化，靶细胞的损伤等一系列免疫反应引起的[8]。往往能够导致移植失败，即使供肾得到挽救，大多也会对肾功能具有近期和远期的影响。

研究人类基因的功能，特别是基因之间相互作用和调控关系，迫切需要一种新的方法，以大规模、高通量的方式进行成千上万个基因在各种生理状态下表达状况的研究[9]。基因芯片是检测样本中上千个基因表达的新方法，不依赖于事先知道哪些基因参与AR。有利于筛查移植组织AR时表达的基因，认识排斥机制和诊断[10]。Akalin等[11]应用基因芯片分析了人移植肾活检标本中6 800个基因的表达，比较了7例急性细胞学排斥的标本和3例没有发生排斥的标本，发现前者有32～219个基因转录产物上调。基因芯片也开始应用于移植肾失功的基因组分析[12]。

目前预防和治疗AR的方法主要是应用甲泼尼龙为主的免疫抑制剂治疗，虽然目前的免疫抑制剂方案已经显著改变了AR的临床表现，但在移植物功能没有明显受损的情况下，通过非侵袭性或低侵袭性的方法及时、准确地检测出能够发展为慢性排斥的AR，仍然是一个重要课题[13]。通过基因芯片技术识别AR的特征，可以对任何免疫抑制方案的患者进行免疫抑制状态的评价，从而判断其免疫抑制是否足够。这将为减少免疫抑制剂提供安全保障，因为可以通过这种方法检测移植肾情况，在移植肾出现明显损伤之前发现排异反应。基因芯片技术也可以应用于新型免疫抑制剂的研发，特别是建立免疫抑制剂的剂量相关性反应及与传统免疫抑制剂的联合应用。

本研究中我们初步得出了与移植肾AR相关的差异基因。据此来预见、诊断移植肾的AR，从而实现移植AR诊断方法上的重复性、低侵袭性与良好敏感性、特异性结合的目标，进而实现免疫抑制方案的个性化，还需要进一步研究证实。