王焕玲 魏志平 郭武 侯晓阳 刘彦群

221002 江苏，徐州医学院附属医院皮肤科

阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖和缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子表达的影响

王焕玲 魏志平 郭武 侯晓阳 刘彦群

221002 江苏，徐州医学院附属医院皮肤科

目的通过阿维A作用于缺氧培养的HaCaT细胞，初步探讨阿维A治疗银屑病的可能机制。方法将浓度为10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞，用CCK⁃8法检测缺氧培养12、24、36 h对HaCaT细胞体外增殖的影响。反转录PCR和Western印迹检测不同浓度阿维A对缺氧培养24 h的HaCaT细胞HIF⁃1α、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白及mRNA表达的影响。结果阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5mol/L作用24 h，HaCaT细胞体外增殖抑制率分别为（13.31± 1.15）%、（21.86± 5.31）%、（32.05± 2.99）%、（37.28 ±3.21）%，且随着缺氧培养时间延长和阿维A浓度增加，对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用逐渐增强。当阿维A浓度为10-5mol/L时，HIF⁃1α蛋白的表达由1.196± 0.088降至0.319±0.180（P＜0.05），而HIF⁃1α mRNA表达水平无明显下降；VEGF mRNA的表达由1.108±0.073降至0.442±0.090（P＜0.05），VEGF蛋白的表达则由1.174±0.186降至0.216±0.066（P＜0.05）。结论阿维A可抑制缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖，并在蛋白水平下调HIF⁃1α及VEGF的表达，在mRNA水平下调VEGF的表达。

阿维A；缺氧；缺氧诱导因子1，α亚基；内皮生长因子；细胞增殖；HaCaT细胞

缺氧诱导因子1（hypoxia⁃inducible factor⁃1，HIF⁃1）是1992年Semenza等发现的一种具有转录活性的核蛋白，可使细胞适应缺氧环境，对氧供与能量稳态起着重要作用［1］。HIF⁃1α是HIF⁃1的功能性亚基，具有广泛的靶基因谱，其中包括与缺氧适应，炎症发展及肿瘤生长等相关的近100种靶基因［2］。银和恶性肿瘤都具有特征性的细胞过度增殖和局域性缺氧［1］，角质形成细胞过度增殖可能导致氧需求增加，表皮肥厚、细胞数目增多也可能导致局部氧供给受损［2］。HIF⁃1α在银屑病主要表达于表皮细胞、真皮浅层毛细血管内皮细胞及其周围部分炎症细胞胞质，且进行期皮损明显高于静止期，在mRNA及蛋白质水平均呈显著上调，提示HIF⁃1α与银屑病的病情进展有关［3］。有报道，HIF⁃1α只是在蛋白水平升高，而mRNA水平变化不明显［4］。阿维A为第2代维A酸类衍生物。维A酸类药物治疗银屑病与其对角质形成细胞增殖、分化及凋亡等过程的调控有关，对维A酸类药物作用机制的研究表明其主要通过结合并激活维A酸核受体对靶细胞产生作用，但具体作用机制尚未完全清楚［5］。我们研究了阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖和HIF⁃1α及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，试图进一步探讨阿维A治疗银屑病的可能机制。

材料与方法

一、试剂

阿维A（重庆华邦制药有限公司），DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），兔抗人HIF⁃1α单克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗人VEGF单克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG、马抗小鼠IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体（美国Bioworld公司），BCA试剂盒（碧云天生物技术有限公司），RT⁃PCR引物设计［生工生物工程（上海）股份有限公司］，反转录PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司），人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞（上海复祥生物科技有限公司）。

二、方法

1.细胞培养及实验分组：HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2常氧培养箱中培养，待细胞长满瓶底后，以含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，接种于培养瓶内，置培养箱中培养24 h贴壁后，更换无血清、无双抗DMEM培养液，并加入不同浓度阿维A，置于37℃、1%O2缺氧培养箱中培养。HaCaT细胞分组处理如下：空白对照组；二甲基亚砜（DMSO）对照组；阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5mol/L组。阿维A处理组缺氧培养24 h，空白对照组分别进行0、12、24、36 h缺氧培养。阿维A以DMSO配制成浓度为10-1mol/L储存液，-20℃避光保存，加药时用无血清、无双抗DMEM培养液稀释至所需浓度（DMSO浓度≤1‰）。与10-5mol/L阿维A所含等体积DMSO组为溶媒组。

2.CCK⁃8法检测HaCaT细胞体外增殖：取对数生长期HaCaT细胞以9×103/ml接种于96孔培养板，每孔100 μl，培养24 h，细胞贴壁后，实验组分别加入含阿维A 10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的培养基，与10-5mol/L阿维A所含等体积DMSO组为DMSO对照组，并设空白对照组，每组设5个复孔，分别缺氧培养12、24、36 h后终止培养，弃去原培养基，将无血清、无双抗DMEM培养液与CCK⁃8试剂按10∶1比例混匀，每孔加入100 μl，于培养箱中孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度A值，实验重复3次取均值计算细胞增殖抑制率，抑制率=（1-阿维A处理组吸光度A值/对照组吸光度A值）×100%。

3.RT⁃PCR法检测HaCaT细胞HIF⁃1α、VEGF mRNA的表达：阿维A处理组各组细胞缺氧培养24 h后提取细胞总RNA，空白对照组分别进行0、12、24、36 h缺氧培养后提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，目的基因HIF⁃1α上游引物：5′⁃GCAAGTC CTCAAAGCACAGTT⁃3′，下游引物：5′⁃CTCAAAGCG ACAGATAACACG⁃3′，扩增片段为311 bp。VEGF上游引物：5′⁃CATGAACTTTCTGCTGTCTTGG⁃3′，下游引物：5′⁃GGTCTGCATTCACATTTGTTGT⁃3′，扩增片段为396 bp。内参照β肌动蛋白上游引物：5′⁃CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC⁃3′，下游引物：5′⁃TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT⁃3′，扩增片段为241 bp。用反转录试剂盒得到cDNA。PCR反应体系为25 μl，扩增条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统扫描拍照，检测各电泳条带的灰度值，计算与β肌动蛋白比值，得到目的产物的相对含量。

4.Western印迹法检测HaCaT细胞HIF⁃1α及VEGF的表达：阿维A处理组缺氧培养24 h后收集各组细胞，空白对照组分别进行0、12、24、36 h缺氧培养后收集细胞，提取总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，上样80 μg进行电泳、转膜及封闭，一抗孵育（兔抗人HIF⁃1α单克隆抗体的浓度为1∶1 000；兔抗人VEGF单克隆抗体的浓度为1∶200，鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体的浓度为1∶1 000），4℃过夜，二抗孵育（山羊抗兔IgG抗体的工作浓度为1∶500；马抗小鼠IgG抗体的工作浓度为1∶500）2 h，BCIP/NBT显色液显色，凝胶成像系统观察结果，目的蛋白条带HIF⁃1α、VEGF与相应的内参β肌动蛋白条带的灰度值比值作为其蛋白表达的半定量指标。

5.统计学分析：用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料用±s表示。多个均数比较用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）。相关性分析用Pearson相关分析。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 阿维A对不同缺氧时间培养的HaCaT细胞体外增殖的影响（±s）

表1 阿维A对不同缺氧时间培养的HaCaT细胞体外增殖的影响（±s）

注：n=3。a：与空白对照组比，P＜0.05；b：与空白对照组组比，P＞0.05；c：与二甲基亚砜对照组比，P＜0.05

组别空白对照组二甲基亚砜对照组阿维A（mol/L）10-8 10-7 10-6 10-5 12 h吸光度A 1.167±0.009 1.151±0.015b 1.067±0.008ac 0.995±0.023ac 0.930±0.023ac 0.800±0.019ac抑制率（%）-1.61±0.97b 8.57±0.14ac 14.68±2.24ac 20.24±1.42ac 31.43±1.65ac 24 h吸光度A 0.862±0.034 0.853±0.026b 0.747±0.020ac 0.673±0.033ac 0.585±0.009ac 0.541±0.031ac抑制率（%）-1.10±0.95b 13.31±1.15ac 21.86±5.31ac 32.05±2.99ac 37.28±3.21ac 36 h吸光度A 0.550±0.013 0.539±0.021b 0.435±0.019ac 0.377±0.018ac 0.330±0.010ac 0.287±0.017ac抑制率（%）-2.02±1.45b 20.86±4.84ac 31.37±4.20ac 40.02±1.50ac 47.74±2.33ac

结 果

一、阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖的影响

阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5mol/L作用于缺氧培养的HaCaT细胞12、24、36 h，对体外增殖均有不同程度的抑制作用，作用24 h后，HaCaT细胞体外增殖抑制率分别为（13.31±1.15）%、（21.86±5.31）%、（32.05±2.99）%、（37.28±3.21）%，随着缺氧培养时间延长和阿维A浓度增加，对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用逐渐增强，在10-5mol/L的阿维A作用下，缺氧培养36 h，HaCaT细胞体外增殖抑制率达（47.74±2.33）%。见表1。

二、阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞HIF⁃1α、VEGF mRNA及其蛋白表达的影响

不同浓度阿维A作用于缺氧培养的HaCaT细胞24 h后，与空白对照组（缺氧培养0 h）相比，HIF⁃1α mRNA的表达，差异无统计学意义（P＞0.05）。而 HIF⁃1α 蛋白、VEGF蛋白及其mRNA表达随着阿维A浓度的增高表达量下降，当阿维A浓度为10-5mol/L时，HIF⁃1α/β肌动蛋白 蛋白灰度比由1.196±0.088降至0.319±0.180，差异有统计学意义（P＜0.05）；VEGF mRNA/β肌动蛋白 mRNA灰度比由对照组1.108±0.073下降至0.442±0.090，VEGF/β肌动蛋白蛋白灰度比由对照组1.174±0.186下降至0.216±0.066，差异有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组中不同缺氧培养时间的HaCaT细胞，与缺氧培养0 h组相比，HIF⁃1α mRNA的表达，差异无统计学意义（P＞0.05）；HIF⁃1α蛋白、VEGFmRNA与蛋白在24 h内随着缺氧培养时间的延长而表达量上调，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表2，3，图1～4。

三、HaCaT细胞HIF⁃1α与VEGF表达量的相关性分析

不同浓度阿维A处理后，HIF⁃1α与VEGF蛋白表达量之间呈正相关，r=0.838，P＜0.05。

表2 缺氧培养对HaCaT细胞缺氧诱导因子1α（HIF⁃1α）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达的影响（±s）

表2 缺氧培养对HaCaT细胞缺氧诱导因子1α（HIF⁃1α）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。a：与缺氧0 h组比，P＞0.05；b：与缺氧0 h组比，P＜0.05

缺氧培养时间0 h 12 h 24 h 36 h HIF⁃1α mRNA 0.873±0.050 0.857±0.079a 0.819±0.073a 0.840±0.084a蛋白0.453±0.065 0.895±0.061b 1.298±0.227b 0.859±0.132b VEGF mRNA 0.651±0.029 0.836±0.014b 1.080±0.079b 0.780±0.095b蛋白0.458±0.061 0.759±0.142b 1.012±0.114b 0.671±0.041b

表3 阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞缺氧诱导因子1α（HIF⁃1α）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达的影响（±s）

表3 阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞缺氧诱导因子1α（HIF⁃1α）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA和蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。a：与空白对照组比，P＞0.05；b：与空白对照组比，P＜0.05

组别空白对照组二甲基亚砜对照组阿维A（mol/L）10-8 10-7 10-6 10-5 HIF⁃1α mRNA 0.891±0.097 0.887±0.111a 0.912±0.108a 0.875±0.100a 0.911±0.097a 0.917±0.085a蛋白1.196±0.088 1.161±0.120a 0.947±0.128b 0.778±0.086b 0.565±0.067b 0.319±0.180b VEGF mRNA 1.108±0.073 1.128±0.069a 0.891±0.069b 0.738±0.056b 0.596±0.036b 0.442±0.090b蛋白1.174±0.186 1.180±0.138a 0.918±0.080b 0.669±0.073b 0.444±0.144b 0.216±0.066b

图1 阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞缺氧诱导因子1α（HIF-1α）mRNA表达的影响 1：空白对照组；2：二甲基亚砜对照组；3～6：分别为阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L组

图2 阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞缺氧诱导因子1α（HIF-1α）蛋白表达的影响 1：空白对照组；2：二甲基亚砜对照组；3～6：分别为阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L组

图3 阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达的影响 1：空白对照组；2：二甲基亚砜对照组；3～6：分别为阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L组

图4 阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响 1：空白对照组；2：二甲基亚砜对照组；3～6：分别为阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L组

讨 论

阿维A治疗银屑病疗效较好。有研究发现，阿维A治疗银屑病患者后皮损处及血清中的VEGF蛋白水平明显低于治疗前［6］。银屑病具有特征性的细胞过度增殖和局域性缺氧［7］。角化是角质形成细胞终末分化阶段，是由肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体导致细胞凋亡。研究表明，缺氧可通过激活自噬从而抑制肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体最终抑制细胞的凋亡［8］。缺氧时肿瘤细胞血管生成和转移潜力增强，如细胞与细胞、细胞与基质之间黏附能力下降［9］。此外，缺氧还可通过下调表皮棘细胞层的标记蛋白K1/K10的水平，导致角质形成细胞的异常分化［10］。本研究结果表明，不同浓度阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖均有不同程度的抑制作用，随着缺氧培养时间延长和阿维A浓度增加，对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用逐渐增强，在阿维A 10-5mol/L的作用下，缺氧培养36 h，HaCaT细胞体外增殖抑制率达（47.74±2.33）%。以往的研究结果表明，阿维A对常氧培养的HaCaT细胞体外增殖具有抑制作用［11］。本研究用缺氧培养方法与银屑病皮损中角质形成细胞所处病理生理环境更趋一致，提示阿维A对缺氧状态下的角质形成细胞同样具有抑制作用。

HIF⁃1α是具有转录活性的核蛋白，因其广泛的靶基因谱在与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等活动中发挥重要作用［2］。本研究发现，不同浓度阿维A处理HaCaT细胞后HIF⁃1α mRNA表达水平无明显变化，而随着阿维A浓度的增加，HIF⁃1α蛋白表达量逐渐下降，与缺氧0 h组相比差异有统计学意义，推测阿维A调节HIF⁃1α可能发生在转录后水平，HIF⁃1α蛋白表达下调可进一步促进下游与血管生成、细胞增殖、迁移和炎症形成相关的靶基因表达发生改变。

VEGF是对血管内皮细胞作用最强的生长因子，能在体内诱导血管新生［12］，是HIF⁃1α重要的靶基因之一［2］。研究表明，VEGF的表达水平与银屑病的严重程度呈正相关关系［3］。有报道将编码VEGF的基因转入小鼠皮肤可致银屑病样改变［13］。本研究发现，阿维A在抑制缺氧培养的HaCaT细胞HIF⁃1α蛋白表达的同时，对VEGFmRNA及蛋白的表达也有较强的抑制作用，且随着阿维A浓度的增加，HIF⁃1α和VEGFmRNA及蛋白水平的表达量逐渐下降。已有研究发现，缺氧诱导HIF⁃1α的产生，从而激活Apelin/APLNR和下游的MAPK信号通路，最终促进血管内皮祖细胞（分化成内皮细胞形成新生血管）的增殖［14］。我们推测阿维A可以直接或间接下调HIF⁃1α的表达，进而使其下游一系列的靶基因如VEGF等的表达下调，促进银屑病皮损的恢复。

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Effects of acitretin onin vitroproliferation of HaCaT cells cultured in hypoxic condition and on expressions of hypoxia⁃inducible factor⁃1α and vascular endothelial growth factor

Wang Huanling,Wei Zhiping,Guo Wu,Hou Xiaoyang,Liu Yanqun
Department of Dermatology,The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China

ObjectiveTo evaluate effects of acitretin on HaCaT cells cultured in hypoxic condition,and to preliminarily explore the possible therapeutic mechanisms of acitretin in psoriasis.MethodsHaCaT cells were divided into several groups to be cultured in hypoxic condition with the presence of acitretin at concentrations of 10-5,10-6,10-7and 10-8mol/L respectively,with cells treated with dimethyl sulfoxide（DMSO）as DMSO control group and those receiving no treatment as blank control group.Cellular proliferative activity was evaluated by CCK⁃8 assay after 12⁃,24⁃and 36⁃hour hypoxic culturein vitro.The mRNA and protein expressions of hypoxia⁃inducible factor⁃1α（HIF⁃1α）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were determined by reverse transcription（RT）⁃PCR and Western⁃blot analysis,respectively,after 24⁃hour hypoxic culture.ResultsAfter 24⁃hour hypoxic culture,the cellular proliferation rate was inhibited by 13.31%±1.15%,21.86%±5.31%,32.05%±2.99%and 37.28%±3.21%in the 10-8⁃,10-7⁃,10-6⁃and 10-5⁃mol/L acitretin groups respectively.With the increase of culture duration and acitretin concentrations,the degree of inhibition on cellular proliferation increased gradually.Compared with the blank control group,the 10-5⁃mol/L acitretin group showed significantly decreased protein expression of HIF⁃1α（0.319±0.180vs.1.196±0.088,P＜0.05）,as well as decreased mRNA and protein expressions of VEGF（mRNA:0.442± 0.090vs.1.108±0.073;protein:0.216±0.066vs.1.174±0.186;bothP＜0.05）.However,no significant difference was found in the mRNA expression of HIF⁃1α between the 10-5⁃mol/L acitretin group and blank control group.ConclusionAcitretin can suppress thein vitroproliferation of HaCaT cells cultured in hypoxic condition,and down⁃regulate the expressions of HIF⁃1α and VEGF proteins as well as VEGF mRNA.

Acitretin;Anoxia;Hypoxia⁃inducible factor 1,alpha subunit;Endothelial growth factors;Cell proliferation;HaCaT cells

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

2016⁃01⁃05）

（本文编辑：吴晓初）

魏志平，Email：xzwzp1961@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.09.003