基于TMCM-6110和LabVIEW的全自动酶联免疫前处理仪的设计

2016-11-03张冰洋

制造业自动化 2016年10期

关键词：下位试剂仪器

万娟，张莉，张冰洋，武力，周盟

（1.中南民族大学检测与仪器校级工程中心，武汉 430074；2.中南民族大学生物医学工程学院，武汉 430074；3.中南民族大学实验教学与实验室管理中心，武汉 430074）

检测与监控

基于TMCM-6110和LabVIEW的全自动酶联免疫前处理仪的设计

万娟1，张莉2，张冰洋3，武力2，周盟1

依据酶联免疫法工艺，我们设计了一款基于TMCM-6110和LabVIEW的全自动酶联免疫前处理仪。采用SolidWorks三维软件对仪器机械结构进行设计；自动控制部分以TMCM-6110为主控板控制步进电机、隔膜泵、蠕动泵和加热片等执行单元；仪器操作界面采用LabVIEW开发，具有操作工序录入、工作状态监控、可供用户自定义样品处理流程等功能。该仪器实现了酶联免疫法检测的实验室全自动化，具有机箱体积小、运行速度快、移液精度高、操作界面友好等特点，完全满足中小型实验室及社区医院的样本检测需求，具有良好的市场前景。

样品前处理；酶联免疫法；SolidWorks；TMCM-6110；LabVIEW

0　引言

酶联免疫测定法（ELISA）相较于高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、液相色谱质谱串联分析技术（LC-MS/MS）等检测方法而言，具有灵敏度高、反应时间短、特异性强、样品量小、污染小、回收率高、重现性好等特点，能有效的测定酶和抗体活性、结合物中酶含量和免疫球蛋白含量、酶与免疫球蛋白摩尔比值以及结合率［1］。

酶联免疫测定法（ELISA）现已成功地广泛应用于生物分析、检验检疫、医学分析领域，尤其在体液检测领域中发挥重要作用。目前，国内大多数中小型分析检测实验室和县区级医院主要采用手工操作来完成酶联免疫测定法实验，费时费力，效率低，且难以保证检测结果的准确性；少数机构采用自动化的酶联免疫分析仪，多为进口仪器，价格昂贵，体积庞大，能耗高，全英文操作界面过于复杂，不易操作。而“十三五”规划纲要指出，深化医药卫生体制改革，实行分级诊疗，让优质医疗设备进入县区级医院，提高基层医疗服务水平，降低医疗费用，从而中小型医院对酶联免疫前处理仪这类检测分析仪器的需求将大幅提高。这类医院进行体液检测时，要求分析检测仪器移液精度高，能耗低，中文操作界面易用性强。

针对这样的市场需求，我们集酶联免疫分析技术、机械设计、光电传感、步进电机控制、软件技术于一体，设计了一款体积小，精度高，可灵活选择板孔，中文操作界面简单人性化的全自动酶联免疫前处理仪，实现了酶联免疫前处理的自动化，提高分析检测实验室的检测效率和检测结果的准确性，同时，价格适中，具有良好的市场前景。

1　基本原理

酶联免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA），是一种在免疫酶技术基础上，发展起来的一种新型的免疫测定的方法，用于检测体液中的微量物质。该方法将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果［2］。在体液检测中，双抗体夹心法是检测血液中抗原含量的最为常用的方法，也是课题组研制仪器运行方案的主要依据之一，如图1所示，仪器运行方案主要有以下七个步骤：

1）加溶剂操作：使待检抗原对应的抗体与固相载体结合，合成固相抗体。

2）洗涤操作：反复洗涤，除去1）未结合的其他物质。

3）加溶剂操作：加入待检样本，充分接触反应之后，样本中的抗原与固相载体相结合，形成固相抗原复合物［3］。

4）洗涤操作：通过洗涤，除去3）未结合的其他物质。

5）加溶剂操作：加入酶标抗体，使之与固相抗原复合物中的抗原相结合。

6）洗涤操作：通过洗涤，除去5）未结合的其他物质。

7）加溶剂操作：加入底物，与酶发生反应，产生有色化合物。根据颜色的深浅来判断待检标本中抗原的量。

图1　酶联免疫法基本原理

2　系统总体设计

全自动酶联免疫前处理仪主要由机械和电控两部分构成。机械部分主要由整体机架、X轴载动系统、Z轴载动系统、移液系统、振荡部件及工作台等零部件组成。课题组依据酶联免疫法实验的工作流程（加试剂、恒温振荡孵育、洗板）来完成仪器的整体布局，将工作台分为四个工位，分别是枪头盒、溶剂盒、废枪头盒、振荡盒，机械结构的设计由SolidWorks三维软件完成。

仪器的电控部分由TMCM-6110主控板、步进电机、电机驱动器、光电传感器、数字温度传感器、加热器、继电器、隔膜泵、蠕动泵等部件组成。仪器工作时，控制系统驱动电机带动相关部件，实现精准定位，完成自动装卸枪头，定量吸、排试剂，吸、排洗涤液，定时恒温振荡等工序，从而完成选定的操作流程。其结构框图如图2所示。

3　控制系统设计

3.1传动控制系统的设计

全自动酶联免疫前处理仪主要目的是完成特定抗体、固相载体、酶标抗体、底物与样品在特定温度下振荡孵育后，反应生成有色产物的过程。这个过程主要依靠传动系统对固定在机械臂上的8通道洗针、移液枪头进行精准定位，确保仪器可以准确地运动到枪头盒、溶剂盒、酶标板的上方，完成相关动作。此需求的主要原因有三方面：1）8通道移液器自动装卸一次性标准枪头，在上枪头时，需要移液器对准工作台的枪头盒工位（X轴位移误差在0.1mm之内移液器才能精准牢固地装载枪头）；2）仪器在抽试剂时，枪头必须对准试剂盒工位，保证枪头在试剂盒的正中间，插入一定的深度，才能确保吸液动作地正常完成；3）洗板时，洗针移动到96孔板的每一排，洗针精准地插入相应板孔，X、Y轴坐标尤为关键。基于此，传动硬件控制系统主要选用Trinamic Motion Control GmbH制造的TMCM-6110主控板、雷塞57系列的两相步进电机、EE-SX672光电传感器。

TMCM-6110的主控芯片为STM32，其集成6轴步进电机控制和驱动于一体，每轴电机自带一组左右限位输入，6路数字量的输出（1A），供电电压为24V。其主要特点是，使用最新的Coolstep技术和stallguard丢步检测技术，电机电流可随电机的负载动态调节，在节能的情况下实现电机的大力矩输出和高速运转，防止因力矩不够而产生的丢步。实验证明，TMCM-6110主控板控制电机带动传动系统的定位精准度完全能够满足仪器对定位系统的要求。

图2　系统结构框图

雷塞57系列两相步进电机为一个执行单位，其步距角为1.8℃，额定电流3A，电源电压为12V～24V。采用了细分方式来解决步进电机低频振动大、噪音大的问题［4］，根据不同的电机载动情况，设置不同的细分参数［5］。TMCM-6110直接控制电机的运转，电机驱动芯片TMC260每输入一个脉冲，电机运行一个步距角，电机带动负载运动，从而实现传动系统的位置控制功能。电机驱动图如图3所示。

图3　电机驱动图

为实现传动系统的精准定位和零点设置功能，选用欧姆龙微型EE-SX672光电传感器，安置于X轴、Z轴、移液器的零点位置。设置零点之后，便于对传动系统设置固定的位置坐标，利于相关部件的移位操作。EE-SX672的应答频率为1kHz的高速响应，电源电压为DC5～24V，采用NPN集电极开路输出模式，常闭，负载电流在40mA～100mA，传感距离为5mm。因电源存在冲击电压，在光电传感器的电源正负极之间并联一个齐纳二极管吸收缓冲电压。本系统采用开关电源24V电压供电，主控板TMCM-6110有六路Reference switch connectors，其输入电压为+5V。为保证光电开关输出信号稳定，OUT端外接一个1kΩ的电阻上拉至+5V电压端。位置检测电路如图4所示。

图4　位置检测电路

3.2移液控制系统的设计

酶联免疫前处理仪研发的重点是8通道移液器的移液精度。经过市场调研之后，本仪器的移液范围设计在10～200µl。移液器由上枪头部件、脱枪头电机、移液电机、移液针管等组成，主要是靠TMCM-6110给移液电机发送脉冲信号带动移液器的活塞运动，通过吸筒抽取定量的试剂。为控制移液器的运行速度及平稳性，对移液电机的细分参数、最大加速度、最大位移速度进行相应的设置。脉冲数和试剂之间的公式为：

式中，X为脉冲数，V为试剂容量，K为丝杆单位长度位移对应的脉冲数，r为活塞杆的内半径。

3.3温度控制系统

在酶联免疫法实验过程中，酶标抗体与样本反应、显色反应等都要求在一定温度恒温孵育振荡。例如酶联免疫法测乙肝病毒，样本与酶标抗体的反应要求在37℃恒温务件下振荡完成。

在本仪器中，为避免模拟电路设计中的引线误差补偿、信号调理误差等一系列问题，温控模块主要采用SRND-CM-DS18控制板控制加热片和DS18B20温度传感器［6］，来实现孵育振荡时的温度控制功能［7］。SRNDCM-DS18控制板选用RS485与上位机通信，波特率设置为9600，4路AI端，4路继电器，24V电源供压。通过接受上位机发出的指令，反馈传感器获取的温度值，控制指定继电器的开关。SRND-CM-DS18控制板在本仪器中，主要负责温度的读取和控制加热片，测温范围是-55℃～125℃，温度精度±0.5℃，温度分辨率为0.1℃。

图5　下位机软件结构

4　软件系统设计

系统软件与硬件电路密切结合是实现仪器正确稳定运行的必要务件。本仪器集机械自动化与计算机实时状态监控和数据存储分析于一体，要求其下位机能够稳定准确地执行上位机发出的指令，上位机实时处理收发数据，显示下位机的运行状态。基于此，课题组提出系统软件设计方案，软件系统分为上位机软件系统和下位机软件系统。

4.1下位机软件系统设计

在主控板TMCM-6110上运行的软件即为下位机软件，在其对应的开发平台上采用TMCL语言开发。下位机软件的主体设计思想主要是总分思想，按功能分为五大模块：

1）参数设定：依据每个电机负载情况及运行速度要求，设定每个电机的细分参数、最大位移速度、最大走位置速度等参数。

2）归零：每次仪器上电，每个轴自动归零点。保证仪器每次开机在初始状态。

3）溶剂操作：首先，移液器运行到枪头盒工位上方，装载指定枪头；移动到溶剂盒工位上方，抽取指定溶剂；移动到酶标板上方，排放溶剂；移动到脱枪头工位，卸掉枪头。

4）振荡孵育：实时获取温度，当实际温度在设定值时，开始振荡，小于设定值时，启动加热片加热。

5）洗板：通过控制隔膜泵和蠕动泵，清洗酶标板的指定排。

其下位机软件结构如图5所示。

4.2上位机软件系统设计

在PC机上运行的软件即为上位机软件，基于LabVIEW图形化编程开发平台，采用485串口通信的方式设计出人性化的人机交互界面。

上位机软件主要实现以下三大功能：1）串口通信功能：依据485通信协议经由USB转485串口线与下位机进行通信，依据选定流程发出相应指令，控制TMCM-6110和温控模块，使各部件完成相应动作。2）人机界面友好交互功能：用户可依据自身实验要求，来自主设定试剂编号、试剂体积、振荡时间、振荡温度、洗板次数和动作先后顺序，实时显示下位机的运行状态。3）数据处理存储功能：上位机软件分析处理存储用户设定的参数，以及从下位机接收的数据。

上位机软件设计主要由以下六大模块组成：1）板孔设置：用户选定96孔酶标板来添加溶剂，逐行选定，避免整板添加浪费时间和材料。2）参数设置：分为试剂设置、振荡孵育设置、洗板设置。试剂设置主要是选定试剂编号和试剂体积，试剂编号一共有六种，分别对应下位机工作台试剂盒工位上的六个试剂位置，体积单位为微升；振荡孵育设置是选定振荡时间和温度；洗板设置是选定洗板次数。3）处理流程设置：将用户设定的参数反映到表格中，便于直观的反应用户选定的实验流程。同时，具备上移、下移、删除、清空、保存、执行等功能键，便于用户更改保存实验流程。在下位机运行时，会以深色选中框来显示正在执行的流程。4）处理流程存储：将处理流程设置模块中的流程编号、命名、存储。5）串口通信、流程执行模块：采用485串口通信的方式，选择串口，与下位机连接通信，收发指令；流程执行按钮控制实验的开始、结束。6）下位机状态监测：通过文字窗口，实时显示下位机正在执行的操作。其上位机软件框图如图6所示。

图6　上位机软件框图

5　仪器性能分析

全自动酶联免疫前处理仪（1台）经检测，其安全性能指标都符合业界标准。采用称重法对仪器的重复性精度、线性精度、工作相对稳定性和通道均一性进行了测试。

表1　测试数据

样品为纯水，室温23℃，选30、60、90、120、150µl（仪器的取样范围在30～160µl）五组，每组加十个样品，加样后在精密天平上称重，再换算成容积。测量数据如表1所示。

1）重复性精度

这里取纯水的密度为1g/mL，由表1易得出每组的平均移液量、标准方差σ、重复性精度CV、绝对误差、相对误差。数据处理结果如表2所示。

由表2可知，仪器移液的重复性精度最大为3.02%，最小为0.49%；移液相对误差为2µl，绝对误差在6.7%～1.3%；目标移液量越大，CV值越小，重复性精度越高，相对误差越小，准确度越高。重复性精度在5%以下，相对误差在7%以下，符合酶联免疫法实验的要求。

表2　重复性精度测试结果

2）线性精度

由图7可知，移液量的线性方程为y=30.2x-1.16。式中，y为实际移液容积，x为目标移液容积。图7说明，实际移液容积量具有线性相关性。

图7　移液线性精度曲线图

3）均一性

图8为移液量为130µl和65µl的情况下，仪器自动上枪头吸取纯净水所得的均一性曲线。由图可知，在130µl时，仪器的移液相对标准偏差（RSD）为0.3829；在65µl时，仪器的移液相对标准偏差（RSD）为0.2476。8通道移液枪的均一性较好，符合酶联免疫法实验的要求。

仪器的各项性能指标如下：

（1）加热范围：室温～100℃；

（2）处理试剂容量：30～160µl；

（3）加热模块温度均匀度：±1℃；

（4）移液重复性精度：±4%；

（5）移液相对标准偏差（RSD）：0.2476。

（6）移液均一性：±3µl；

图8　通道移液均一性曲线图

6　结束语

我们设计的全自动酶联免疫前处理仪，上位机中文操作界面友好，可操作性强，可实时显示下位机的运行状态；实现高通量、高效率、无污染的样品前处理。实验结果表明，该仪器能够达到酶联免疫法体液检测实验的各项性能要求，移液精度高，耗时短，运行稳定，安全可靠。仪器整体体积小，价位适中，工位划分细致，便于维修，适用于中小型实验室和县区级医院，具有良好的市场前景。

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The design of fully automatic ELISA pretreatment instrument based on TMCM-6110 and LabVIEW

WAN Juan1， ZHANG Li2， ZHANG Bing-yang3， WU Li2， ZHOU Meng1

TP29

1009-0134（2016）10-0001-06

2016-05-26