张　馨, 李　扬, 曹　红, 欧阳巧凤,, 郑兰兰,4, 李　春

(1. 石河子大学化学化工学院, 石河子 832003; 2. 嘉兴学院生物与化学工程学院, 嘉兴 314001;3. 北京理工大学生命学院, 北京 100081; 4. 喀什大学化学与环境科学学院, 喀什844006)



双三氟甲烷磺酰亚胺类离子液体对产紫青霉菌株全细胞催化特性的影响

张馨1, 李扬1, 曹红2, 欧阳巧凤1,2, 郑兰兰1,4, 李春3

(1. 石河子大学化学化工学院, 石河子 832003; 2. 嘉兴学院生物与化学工程学院, 嘉兴 314001;3. 北京理工大学生命学院, 北京 100081; 4. 喀什大学化学与环境科学学院, 喀什844006)

研究了双三氟甲烷磺酰亚胺阴离子Tf2N-分别与5种不同阳离子组成的离子液体对产紫青霉菌(PenicilliumpurpurogenumLi-3)的生长、 代谢、 细胞膜透性及全细胞催化活性的影响. 结果表明, [N1,4,4,4]Tf2N对产紫青霉菌的生长有促进作用, [Py14]Tf2N, [Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N 4种离子液体对产紫青霉菌的生长则均有不同程度的抑制. 代谢活力保留值R的测定结果表明, [P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N对产紫青霉菌体细胞表现出相对较高的生物相容性; 5种离子液体对菌体细胞的细胞膜透性均有改善作用. 全细胞催化反应数据显示, 最优离子液体为[Py14]Tf2N, 当其加入量为25%, 反应84 h后, 单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)产率高达95.38%. 5种离子液体对产紫青霉菌的生长、 代谢、 细胞膜透性及全细胞催化活性的影响不仅与阴离子Tf2N-有关, 阳离子的组成、 结构和性质也发挥重要的作用.

双三氟甲烷磺酰亚胺阴离子; 阳离子; 离子液体; 产紫青霉菌; 单葡萄糖醛酸基甘草次酸

全细胞生物转化过程的反应介质主要有水和有机溶剂两大体系, 与水相中的生物催化反应相比, 非水相介质中生物催化反应具有较特殊的优势, 然而酶的立体选择性和催化活性一般会受到传统有机溶剂的限制, 有机溶剂本身的毒害性会对细胞膜造成一定程度的破坏, 从而影响催化效率, 同时也会造成化学工业污染. 针对这一问题, 目前较多使用新型的绿色溶剂离子液体(ILs)作为生物催化反应的介质.

将离子液体/水双相体系应用于生物催化反应, 既可以充分利用离子液体能够促进生物催化活性和环境友好的特点, 又能克服底物或产物在水相中溶解度低、 不稳定及反应物对催化反应产生抑制等缺点[1]. Schöfer等[2]在甲基叔丁基醚(MTBE)和10种不同离子液体中对8种不同脂肪酶和2种酯酶的活性进行了检测, 结果显示, 在离子液体[Mmim]Tf2N双相体系中脂肪酶Pseudomonas和Alcaligenes的对映体选择性比在MTBE中显著提高, 且酶在离子液体[Mmim]Tf2N, [Omim][PF6]和[Bmim]5[CF3SO3]中可以保持良好活性. Robert等[3]发现疏水性离子液体[NMeOct3][Tf2N]和[P6,6,6,14]5[Tf2N]作为催化介质均能提高重组E.coli细胞对甲苯双加氧催化的效率, 这2种离子液体对E.coli细胞都具有良好的生物相容性, 离子液体/水双相体系可有效保护细胞免受底物甲苯的毒害作用; 与水相体系相比, 细胞对甲苯的耐受性提高了8倍, 产物甲苯顺乙二醇浓度提高了2.5倍; Kohlmann等[4]在短乳杆菌乙醇脱氢酶催化难溶于水的脂肪族酮类还原反应中使用水溶性离子液体作为添加剂, 提高了反应的立体选择性; Lourenco等[5]发现1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯与A型明胶形成的离子凝胶包载氧化酶的催化效果良好, 当基质浓度大于0.15 mmol/L时, 包载后的辣根过氧化物酶还能保持91%的初始酶活性, 而游离的辣根过氧化物酶则已失活, 说明离子液体与明胶复合材料能实现酶在较高浓度基质中的酶促反应; Lütz研究小组[6]报道了3种典型的电化学酶在水溶性离子液体中的催化合成反应, 发现在离子液体中还原型辅酶Ⅱ化学再生的空时产率提高了3倍; 在氨基酸氧化酶催化拆分外消旋蛋氨酸反应中, 酶辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸通过二茂铁羧酸再生的空时产率提高了50%, 催化剂利用率也提高了140%; 此外, 在含离子液体的氯过氧化物酶催化(R)-苯基甲基亚砜过程中, 所需的共基质H2O2再生的空时产率和催化剂利用率增加了1～4.2倍不等, 增加多少主要取决于离子液体的类型[7].

当阴离子为双三氟甲烷磺酰亚胺(Tf2N-)时, 大部分离子液体与水不互溶, 与缓冲溶液体系形成双相体系. 在前期研究结果[8～12]的基础上, 本文选用阴离子Tf2N-分别与5种不同阳离子组成的离子液体作为反应介质, 从产紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3)细胞的生长、 代谢、 细胞膜透性和催化活性等方面进行研究, 期望从离子液体的组成结构上找到离子液体对细胞催化作用的影响规律.

1　实验部分

1.1试剂与仪器

产紫青霉PenicilliumpurpurogenumLi-3为本实验室保存菌种. 甲基三丁基铵双三氟甲烷磺酰亚胺盐([N1,4,4,4]Tf2N)、N-甲基-N-丁基吡咯烷双三氟甲烷磺酰亚胺盐([Py14]Tf2N)、 1-丁基吡啶双三氟甲烷磺酰亚胺盐([BPy]Tf2N)、 己基三丁基膦双三氟甲烷磺酰亚胺盐([P6,4,4,4]Tf2N)和1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲烷磺酰亚胺盐([Bmim]Tf2N), 纯度均>98%, 购自中国科学院兰州化学物理研究所; 其余试剂均为分析纯.

LC-10A型高效液相色谱仪(HPLC)和光电二极管阵列(PDA)检测器(日本岛津公司); InertSustain C18柱(4.0 mm×250 mm, 日本GL Science公司); LCsolution型紫外检测器(日本岛津公司).

1.2离子液体对产紫青霉细胞生长活性的影响实验

向5只锥形瓶中各加入100 mL基础产酶培养基, 再分别加入2 mmol [BPy]Tf2N, [Py14]Tf2N, [N1,4,4,4]Tf2N, [P6,4,4,4]Tf2N和[Bmim]Tf2N 5种离子液体. 经灭菌、 冷却及接种产紫青霉后, 于32 ℃, 150 r/min转速下培养96 h, 取出, 抽滤, 将附着菌体的滤纸(已于80 ℃恒重)置于80 ℃恒温干燥箱中恒重, 计算菌体干重[以细胞干重(DCW) g/L计]. 另取空白组[不接菌, 加入相同体积磷酸盐(PB)缓冲液]和对照组(接菌, 加入相同体积PB缓冲溶液), 按照相同方法处理. 平行重复实验3次, 取平均值.

1.3离子液体对产紫青霉细胞的生物相容性实验

以产紫青霉细胞在离子液体中的糖代谢活力保留值(R)[13]来评价离子液体对产紫青霉菌株细胞的生物相容性. 将5种离子液体分别与PB缓冲溶液(0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, pH=7.0)按照体积比1∶1配成混合体系, 然后分别准确移取5 mL混合体系溶液加入6支10 mL离心管中, 离子液体体积分数分别为0, 6%, 10%, 14%, 20%和25%, 再各加0.15 g产紫青霉湿菌体, 于32 ℃, 150 r/min转速下, 浸泡24 h后, 离心, 除去上层清液. 用生理盐水(质量分数0.9%)洗涤菌体, 离心, 除去上层清液后, 加入5 mL葡萄糖溶液(1.0 g/L), 在32 ℃, 150 r/min转速下振摇4 h, 离心. 准确移取1 mL上清液于25 mL容量瓶中定容, 采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)[14]法测定其中葡萄糖的含量. 另取空白组(将0.15 g湿菌体微波灭活后, 加入5 mL离子液体/PB缓冲溶液的混合体系中浸泡24 h)和对照组(将0.15 g湿菌体加入5 mL PB缓冲溶液中浸泡24 h)按照相同方法处理和测定, 计算R值. 平行重复实验3次, 取平均值.

1.4离子液体对产紫青霉细胞膜透性的影响实验

将5种离子液体分别与PB缓冲溶液(0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, pH=7.0)按照体积比1∶3配成混合体系, 然后分别准确移取5 mL混合溶液加入6支20 mL离心管中, 再各加入0.5 g湿菌体, 于32 ℃, 150 r/min转速下振摇. 每隔2 h准确移取0.5 mL发酵液, 测定其中蛋白质[15]和核酸[16]的含量. 另取对照组(将0.5 g湿菌体加入5 mL PB缓冲溶液中)按照相同方法处理和测定. 平行重复实验3次, 取平均值.

1.5离子液体对产紫青霉全细胞催化活性的影响实验

取6支10 mL离心管, 分别加入4 mL含2.8 g/L甘草酸(GL)的底物溶液(由0.2 mol/L, pH=7.0的PB缓冲溶液配制)和0.15 g产紫青霉湿菌体, 按照一定的体积分数(0, 6%, 10%, 14%, 20%和25%)分别加入[BPy]Tf2N, [Py14]Tf2N, [N1,4,4,4]Tf2N, [P6,4,4,4]Tf2N和[Bmim]Tf2N 5种离子液体, 再用PB缓冲液(0.2 mol/L, pH=7.0)定容至6 mL. 置于常压恒温摇床上(32 ℃, 150 r/min)反应, 间隔一定时间取反应液离心(10000 r/min, 2 min)后, 移取0.5 mL上层清液, 用甲醇定容于10 mL容量瓶中, 过滤后, 用高效液相色谱检测[17], 检测波长254 nm, 流动相甲醇与重蒸水(加入适量醋酸, pH=2.85)体积比为81∶19, 流速为0.7 mL/min, 柱温箱为40 ℃, 进样20 μL. 取样的时间间隔为20, 40, 60和84 h. 平行重复实验3次, 取平均值.

1.6数据处理

高效液相色谱(HPLC)的主要仪器参数参见文献[18]. 计算公式为YGAMG=PGAMG/S0(YGAMG为GAMG的产率,PGAMG为反应后产物GAMG的浓度,S0为反应前底物GL的初始浓度).

2　结果与讨论

2.1离子液体对产紫青霉细胞生长活性的影响

由图1可见, 在相同培养条件下, 与对照组相比, [N1,4,4,4]Tf2N对菌体生长有一定的促进作用, 这可能是因为[N1,4,4,4]Tf2N在培养基中能解离出铵离子, 给菌体提供了生长所需要的营养物质所致. [Bmim]Tf2N对菌体生长则产生了较明显的抑制, 其次是[BPy]Tf2N, 而[Py14]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N对菌体生长抑制作用较弱, 这4种离子液体对菌株细胞生长的抑制作用可能与阴离子Tf2N-能够强效抑制细胞内Na+-K+-ATP+酶的活性[19]有关, 而抑制作用的强弱则与阳离子的组成、 结构和性质有关.

Fig.1　　　　Influence of ionic liquid on the cell biomass a. Aqueous; b. [Bmim]Tf2N; c. [BPy]Tf2N; d. [Py14]Tf2N; e. [N1,4,4,4]Tf2N; f. [P6,4,4,4]Tf2N.

Fig.2　Metabolic activity retention(R) of Penicillium purpurogenum Li-3 cell in different ionic liquidsa. Aqueous; b. [Bmim]Tf2N; c. [BPy]Tf2N; d. [Py14]Tf2N; e. [N1,4,4,4]Tf2N; f. [P6,4,4,4]Tf2N.

2.2离子液体对产紫青霉细胞的生物相容性

糖代谢是细胞基本的代谢活动, 可用细胞糖代谢活力保留值R表征细胞的代谢活力和生长状况. 若溶剂的毒性越小, 则R值越大, 表明溶剂对细胞的生物相容性越好[20]. 由图2可知, 5种离子液体按照代谢活力保留值R由大到小的顺序为[P6,4,4,4]Tf2N >[N1,4,4,4]Tf2N >[Py14]Tf2N >[Bmim]Tf2N >[BPy]Tf2N. 其中, [P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N的R值相近, 二者仅略低于水溶液的R值, 且比其它3种离子液体的R值均大, 说明这2种离子液体对产紫青霉Li-3菌体细胞表现出相对较高的生物相容性. 根据相关离子液体对微生物毒性研究[19]的报道, 由于这2种离子液体的阳离子结构中都不含有芳香烃或其它环状结构, 亲油性低, 且半径比较大, 因此其对菌体细胞的潜在毒性较小, 对菌体代谢的抑制作用弱. 此外, 由图2还可知, [BPy]Tf2N的R值最小, 表明在5种离子液体中, [BPy]Tf2N对菌体代谢活力的抑制作用最强. 这可能与[BPy]Tf2N的阳离子带有芳香性的吡啶环有关. [Bmim]Tf2N和[Py14]Tf2N的阳离子分别带有芳香性的吡咯环和饱和五元杂环, 这也是导致它们对菌体代谢活力的抑制作用相对较强的原因. 因此, 可以推断阳离子结构上的差异是导致这5种离子液体对产紫青霉细胞毒性差异的根本原因.

2.3离子液体对产紫青霉菌株细胞膜透性的影响

如图3所示, 在相同时间下, 5种离子液体介质中菌体细胞透出蛋白质和核酸的量不同; 对于同一种离子液体, 不同反应时间的细胞透出蛋白质和核酸的量也不相同. 这说明5种离子液体均对细胞膜透性有不同程度的改善作用, 这与离子液体的疏水基团可与细胞壁/脂质膜上的亲脂基团发生相互作用[21]有关. 实验测定的5种离子液体介质中, 透出蛋白质含量的顺序为[Bmim]Tf2N>[BPy]Tf2N>[Py14]Tf2N>[N1,4,4,4]Tf2N>[P6,4,4,4]Tf2N, 透出核酸含量的顺序为[Bmim]Tf2N>[BPy]Tf2N>[Py14]Tf2N>[P6,4,4,4]Tf2N>[N1,4,4,4]Tf2N. 说明[Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N和[Py14]Tf2N这3种离子液体对菌体透出蛋白质及核酸含量都比在水溶液和其它2种离子液体介质中多, 对细胞膜透性的改善作用较大; 而其它2种离子液体[P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N对细胞膜透性改善作用较小. 其原因可能是[P6,4,4,4]Tf2N和[N1,4,4,4]Tf2N这2种离子液体的阳离子都不含环状结构, 且半径都比较大, 其对菌体细胞的潜在毒性较小, 因此对细胞膜的穿透作用较弱.

Fig.3　　　　Strain cell membrane permeability with proteins(A) and RNA(B) in 25%(volume fraction) different ionic liquids a. Aqueous aqueous; b. [BPy]Tf2N; c. [Py14]Tf2N; d. [N1,4,4,4]Tf2N; e. [P6,4,4,4]Tf2N; f. [Bmim]Tf2N.

2.4离子液体对产紫青霉全细胞催化反应的影响

在甘草酸生物转化体系中分别加入5种离子液体, 考察了阳离子种类及添加离子液体浓度对产紫青霉全细胞催化进程的影响, 结果如图4所示.

Fig.4　　　　Effect of ionic liquids with different volume fraction on the yield of GAMG (A)[Bmim]Tf2N; (B)[BPy]Tf2N; (C)[Py14]Tf2N; (D)[N1,4,4,4]Tf2N; (E)[P6,4,4,4]Tf2N; a. Aqueous; volume fraction of ionic liquid: b. 6%; c. 10%; d. 14%; e. 20%; f. 25%.

由图4(A)可知, 随着反应时间延长, 在5种离子液体介质中, GAMG产率均呈持续增加趋势, 并且在反应20 h后, 5种离子液体介质体系中GAMG的产率均逐渐明显高于纯缓冲液体系.

从介质中离子液体的浓度变化分析可见, 当[Bmim]Tf2N体积分数为25%时, 反应84 h后GAMG产率达76.2%[图4(A)]; 当反应84 h时, 在分别加入体积分数20%和25%[BPy]Tf2N体系中, GAMG产率均趋于60.9%[图4(B)]; 反应20 h后, GAMG的产率在含不同浓度[Py14]Tf2N的介质体系中均比在纯缓冲溶液体系中明显提高, 并且GAMG产率随着加入离子液体体积分数的增大而升高[图4(C)], 当加入体积分数为25%, 反应84 h时, GAMG的产率达95.4%; 含不同浓度的[N1,4,4,4]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N介质体系对全细胞催化GL合成GAMG也同样具有促进作用, 在加入体积分数为25%, 反应84 h时, 在[N1,4,4,4]Tf2N和[P6,4,4,4]Tf2N介质体系中GAMG产率分别达81.2%和71.6%[图4(D)和(E)].

全细胞催化活性的大小是由离子液体对细胞的生物相容性和细胞生长活性的影响、 离子液体对细胞膜通透性改善的程度以及离子液体中阴、 阳离子对酶催化活性的影响等多方面因素共同作用决定的. 5种离子液体对产紫青霉全细胞催化活性均具有促进作用, 这是因为其阴离子Tf2N-为疏水基团, 可以和细胞壁/脂质膜上的亲脂基团相互作用而穿透细胞膜内, 其疏水性可导致胞内酶蛋白质周围水的活性提高, 游离水分子促使酶蛋白趋于以活性增强的构象表达酶活性[21].

5种离子液体对全细胞催化促进作用的强弱顺序为[Py14]Tf2N >[N1,4,4,4]Tf2N >[Bmim]Tf2N >[P6,4,4,4]Tf2N >[BPy]Tf2N. 由于[Bmim]Tf2N和[BPy]Tf2N的阳离子中含有芳香杂环, 对细胞的生长具有明显的抑制作用, 且具有较强的毒性, 因此减小了离子液体对全细胞催化反应的促进程度. [P6,4,4,4]Tf2N对菌体生长虽然没有明显的抑制作用, 且具有较好的生物相容性, 但因其阳离子尺寸较大, 进入细胞内较困难, 对酶催化的促进作用较弱. [N1,4,4,4]Tf2N对菌体生长有一定的促进作用, 且生物相容性较好, 其阳离子尺寸也比[P6,4,4,4]Tf2N要小, 因此在阴离子的作用下, 相对较容易进入细胞内对酶催化反应产生促进作用. [Py14]Tf2N对细胞的生长活性略有抑制, 并且对菌体也有一定毒性, 但却对全细胞催化反应表现出很强的促进作用. 这一特殊现象与Allen等[22]的实验结果相似, 可解释为这种离子液体能通过对细胞呼吸过程的抑制促使NADH和O2转向高表达的生物催化过程, 从而阻止细胞对一些非生产性底物的消耗, 使反应向更有利于生成产物方向进行.

3　结　　论

研究了5种双三氟甲烷磺酰亚胺类离子液体对产紫青霉菌生长、 代谢、 细胞膜透性以及全细胞催化活性的影响. 结果表明, 5种离子液体对产紫青霉菌生长、 代谢、 细胞膜透性及全细胞催化活性的影响与其阳离子的组成、 结构和性质密不可分; 与其它4种离子液体相比, [Py14]Tf2N在产紫青霉全细胞催化GL合成GAMG的过程中表现出更大的促进作用. 本文结果为双三氟甲烷磺酰亚胺类离子液体应用于生物催化领域提供了理论依据.

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(Ed.: P, H, S, K)

† Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21146012, 21266029).

Effect of the Ionic Liquids with Anion Tf2N-on the Whole Cell Catalytic Properties ofPenicilliumPurpurogenumLi-3 Strain†

Zhang Xin1, LI Yang1, CAO Hong2*, Ouyang Qiaofeng1,2, Zheng Lanlan1,4, LI Chun3

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China; 2.CollegeofBiological,ChemicalSciencesandEngineering,JiaxingUniversity,Jiaxing314001,China; 3.SchoolofLifeScienceandTechnology,BeijingInstituteofTechnology,Beijing100081,China; 4.CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,KashiUniversity,Kashi844006,China)

PenicilliumpurpurogenumLi-3 cells properties of growth, metabolism, permeability of cell membrane and catalysis were studied in five ionic liquids composed with anion Tf2N-and five different ca-tions. The results showed that, the ionic liquids [Py14]Tf2N, [Bmim]Tf2N, [BPy]Tf2N and [P6,4,4,4]Tf2N had inhibitory effect on the growth ofpenicilliumpurpurogenumLi-3 while ionic liquid [N1,4,4,4]Tf2N had a promoting effect. Through metabolic activity determination of retention value(R) in ionic liquids, [P6,4,4,4]Tf2N and [N1,4,4,4]Tf2N showed relatively high biocompatibility to cells. At the same time, five ionic liquids on cell membrane permeability were improved effect. Whole-cell catalysis results displayed that [Py14]Tf2N was optimal ionic liquid. When the addition of [Py14]Tf2N was 25%, after 84 h, glycyrrhetinic acid monoglucuronide(GAMG) rate and glycyrrhizin acid(GL) conversion rate were as high as 95.38% and 99.84%. Therefore, the addition of [Py14]Tf2N, greatly promoted the formation of conversion and product. It showed that the effects of five kinds of ionic liquids on cells properties of growth and metabolism, cell membrane permeability and the whole cell catalytic activity were not only related to the anion Tf2N-, but also played an important role in the composition, structure and properties of the cations.

Tf2N-; Cation; Ionic liquid;PenicilliumpurpurogenumLi-3; Glycyrrhetinic acid monoglucuronide

10.7503/cjcu20160201

2016-03-31. 网络出版日期: 2016-09-23.

国家自然科学基金(批准号: 21146012, 21266029)资助.

O643; Q556+.2

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联系人简介: 曹红, 女, 博士, 研究员, 主要从事生物催化与酶工程研究. E-mail: chyf_ch@126.com