张 英 刘 影 刘 洋 强 珊 杨冰莹 黄琳娟 王仲孚

（西北大学生命科学学院，西安 710069）

微量生物样品中糖蛋白N-糖链电喷雾电离质谱分析前处理方法的建立

张 英 刘 影 刘 洋 强 珊 杨冰莹 黄琳娟 王仲孚*

（西北大学生命科学学院，西安 710069）

基于电喷雾电离质谱检测技术，建立了一种可靠、高效、简单，适合于微量糖蛋白N-糖链解离、富集纯化的方法。以糖蛋白牛胰核糖核酸酶（Rib B）和卵清白蛋白（OVA）为模型蛋白直接酶解，比较了4种方法纯化酶解样品的效果。比较了直接酶解和经过聚偏氟乙烯（PVDF）膜富集后酶解微量复杂生物来源样品胎牛血清的酶解效果，最终建立了微量生物样品中糖蛋白N-糖链的质谱分析前处理方法。采用PVDF膜吸附复杂生物样品中的糖蛋白，N-糖苷酶F（PNGase F）酶直接在膜上完成糖链释放（37℃，24 h），采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化，用于微克级胎牛血清和健康人血清中N-糖链质谱分析的前处理。本方法通用性好，在微量生物样品糖链质谱分析检测的前处理方面具有一定应用价值。

微量分析；糖蛋白；N-糖链；电喷雾质谱；前处理

1 引言

蛋白质糖基化是真核细胞中最常见的翻译后修饰，对蛋白质生物学功能的发挥起着至关重要的作用。糖蛋白上的糖链具有高度的微不均一性，在癌症、衰老等不同的病理生理条件下会发生变化［1］。以糖链作为研究对象，筛选癌症血清标志物，可以为癌症的早期诊断、预后、治疗反应预测和群体筛查开辟新的途径［2］。

血清中糖蛋白的特点是微量、成分复杂、糖链含量更少。质谱技术具有微量、快速、准确和高通量的优点，能满足对微量糖链的分析，为研究生物来源样品提供了强有力的手段［3］。但质谱技术对复杂生物样品的前处理要求高，样品中的杂质会影响糖链的质谱分析。血清成分十分复杂，含有大量蛋白质，以及很多小分子物质如盐类、脂类和游离糖等［4］，给糖组研究带来困难。聚偏氟乙烯（PVDF）膜由于带有负电荷，可与蛋白质中的带正电氨基酸吸附结合，已广泛应用于蛋白的吸附和转移［5］。在PVDF膜上采用最常用的N-糖苷酶F（PNGase F）［6］酶解法释放N-糖链，解离后的糖链常与蛋白质变性剂、缓冲剂以及肽段等杂质混在一起，导致糖链的信号被严重抑制。另外，高丰度糖链还会掩盖低丰度糖链，降低了样品中全部糖链被鉴定的几率。因此在糖链的质谱分析中，对解离后的样品进行纯化和富集至关重要。常用的方法有石墨碳柱、C18柱、阳离子交换树脂、Bio-Gel P4或Sephadex G10等，但这些方法的纯化效果不稳定，应用时有一定的局限性。Bio-Gel P4和Sephadex G10均属于凝胶排阻色谱，填料前处理步骤复杂，纯化效率缓慢，不适于高通量纯化游离糖链。离子交换树脂对糖链无保留，通过H+和盐类阳离子的交换达到除盐的目的，但可能会造成带电荷糖链的丢失。C18柱能够吸附水溶液中的疏水性物质，比如蛋白质，但对亲水物质例如糖链只有很弱的亲和力，因此C18柱常被用于分离蛋白质与糖链。石墨碳柱基于填充剂与样品的疏水相互作用，以及电子受体-供体之间的相互作用，不但可以快速分离糖链和蛋白质，还能除去盐类、去垢剂等。微晶纤维素柱能够吸附极性较大的物质，但对疏水性的物质吸附能力弱，因此被用于糖链与疏水性杂质的分离纯化［7～9］。但在实际样品分析时，单一使用一种方法得到的样品往往无法满足质谱分析的要求，经常由于杂质的干扰而造成质谱信号丢失。因此需要联合使用这些方法，实现糖链的有效富集和纯化。

本研究以糖蛋白牛胰核糖核酸酶（Rib B）和卵清白蛋白（OVA）为模型蛋白，采用PVDF膜吸附糖蛋白，PNGase F直接在膜上完成糖链释放。比较了常用色谱柱联合使用对糖链的纯化效果，最终确定采用微晶纤维素柱结合石墨碳柱对糖链进行富集纯化，进行电喷雾质谱检测前的样品制备。将本方法应用于微克级微量复杂生物样品如人和胎牛血清中N-糖链质谱分析的前处理，效果良好。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LTQ-XL电喷雾电离质谱仪（ESI，美国Thermo Finnigan公司）。鸡卵清白蛋白（OVA）、微晶纤维素填料、阳离子交换树脂均为Sigma公司产品；N-糖苷酶F（PNGase F，美国Bio-Rad公司）；牛胰核糖核酸酶B（Rib B，Worthington公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin，1∶250）、聚偏氟乙烯膜（PVDF，0.45μm）均购自西安舟鼎国有限公司；石墨碳柱、C18小柱（美国Waters公司）；其余试剂均为国产分析纯。健康人O型Rh（+）血清由西安交通大学附属医院提供；实验用水由Millipore Integral制备。

2.2 质谱条件

质谱分析条件参考文献［9］。电喷雾离子源（ESI）；正负离子模式扫描，扫描范围为中分子量端m/z 150～2000及高分子量端m/z 2000～4000；电喷雾电压：4.00 kV；鞘气（N2）：30.00 arb；辅助气（N2）：5.00 arb；吹扫气（N2）：0 arb；离子传输毛细管温度：300℃；管透镜电压：250V；进样量2 μL，流动相是50%甲醇，流速为200 μL/min。

2.3 N-糖链的解离方法

2.3.1 方法1［10］50 μg糖蛋白溶于100 μL蛋白质变性液，沸水浴10 min，冷却至室温，加10 μL酶解缓冲液（1.9 g Na3PO4溶于10 mL水中，pH 7.5），10%NP40（乙基苯基聚乙二醇）及0.25 μL PNGase F，37℃反应24 h。

2.3.2 方法2（改进N-糖链解离方法）将PVDF膜剪成约2 mm×2 mm的小块，用70%甲醇润洗3次使其充分活化，然后水洗5次除去甲醇。在PVDF膜表面滴加5 μL血清样品，室温孵育1 h；在PVDF膜还未干燥时迅速用水轻微润洗3次，然后放入离心管中，后续的糖链解离酶解反应如方法1所述。

2.4 糖链的富集纯化方法

2.4.1 微晶纤维素纯化方法［9］将微晶纤维素粉末装入层析柱（30 mg/mL）中，用约50倍柱体积的水充分洗去填料中的杂质；再用约3倍柱体积洗脱液（正丁醇-甲醇-水，4∶1∶1，V/V）平衡柱子；上样后，用约50倍柱体积平衡液洗脱除去蛋白质或多肽杂质；最后分管收集2倍柱体积的水洗脱液，即为目标产物。

2.4.2 阳离子交换树脂纯化方法［11］将树脂装入层析柱（30 mg/mL）中，用约5倍柱体积水洗去填料中的杂质；样品用水溶解，上样，直接分管收集2倍柱体积的水洗脱液，即为目标产物。

2.4.3 C18柱纯化方法［12］用5倍柱体积的乙腈活化C18柱（100 mg/mL），然后用5倍柱体积的5%乙酸溶液平衡柱子，上样，直接分管收集2倍柱体积的洗脱液，即为目标产物。

2.4.4 石墨碳柱纯化方法［12］用5倍柱体积乙腈活化石墨碳柱（37.5 mg/mL），再用5倍柱体积的水平衡柱子；上样后，用50倍柱体积水除去盐、蛋白质和多肽等杂质；最后用0.1%三氟乙酸-25%乙腈洗脱糖链，分管收集2倍柱体积洗脱液，即为目标产物。

2.5 N-糖链富集纯化方法的优化

分别采用微晶纤维素结合阳离子交换树脂（图1A）、C18柱结合石墨碳柱（图1B）、C18柱结合阳离子交换树脂柱（图1C）、石墨碳柱结合微晶纤维素柱（图1D）的方法，对糖蛋白标准品Rib B和OVA中的N-糖链进行处理。

3 结果与讨论

3.1 N-糖链富集纯化方法的考察

以标准糖蛋白Rib B和OVA为模型，考察了对单一蛋白酶解后糖链的富集纯化方法。发现石墨碳柱结合微晶纤维素法纯化得到的样品质谱信号相对较好。图2是Rib B酶切后用上述石墨碳柱结合微晶纤维素柱富集纯化后得到的质谱图。每条糖链都有两种加和峰，即［M+H］+和［M+Na］+，对应着质谱图上的5组峰，与文献［8］报道一致，证明了上述纯化方法在样品质谱分析前处理的可行性。石墨碳柱具有同时除去蛋白和盐类等杂质的能力，而且除盐、表面活性剂等杂质的效果较为显著；微晶纤维素柱能够很好地分离蛋白、多肽与游离糖链，除蛋白能力较强。联合使用两种技术，综合其优点，效果良好。

图1 N-糖链富集纯化的4种方法Fig.1 Four methods for purifying and enriching N-linked glycans from mixture

图3是OVA酶切后用上述石墨碳柱结合微晶纤维素柱富集纯化后检测得到的质谱图。共检测到18条糖链的单糖组成，结果与文献［13］一致，同样证实了该糖链纯化方法的可行性。

3.2 微量复杂生物样品中糖蛋白N-糖链质谱检测前处理方法的建立

3.2.1 N-糖链解离方法以生物样品胎牛血清为例，分别用方法1和2解离N-糖链，石墨碳柱结合微晶纤维素柱富集纯化，质谱检测。图4是胎牛血清样品用方法1解离得到的N-糖链的质谱图，杂质峰较高，基线不平稳，对低丰度糖链的分析鉴定干扰较大，只检测到4条主要糖链。图5是用PVDF膜法（方法2）得到的N-糖链的质谱图，改进的糖链解离方法能显著增强后续的富集纯化效果，除与图4一致的4条糖链外，还出现了不同程度唾液酸化的N-糖链，糖链归属见表1，结果与文献［14］一致，说明与传统方法相比，所建立的方法富集纯化效果更好，可以得到更丰富的糖链信息。

图2 Rib B N-糖链的正离子模式的ESI-MS分析谱图Fig.2 Positive ion ESI-MS spectrum of N-linked glycans from bovine ribonuelease B（Rib B）

图3 鸡卵清白蛋白N-糖链的正离子模式的ESI-MS分析谱图Fig.3 Positive ion ESI-MS spectrum of N-linked glycans from ovalbumin from chicken egg white

图4 直接酶解的胎牛血清N-糖链的ESI-MS分析谱图Fig.4 ESI-MS analysis of N-linked glycans from fetal bovine serum by direct enzymolysis

图5 PVDE膜富集后酶解的胎牛血清中N-糖链的负离子模式的ESI-MS分析谱图Fig.5 Negative ion analysis of N-linked glycans from fetal bovine serum by enzymolysis after polyvinylidene fluoride（PVDF）enrichment

表1 胎牛血清中N-糖链的结构推测表Table 1 Composition of N-linked glycans from fetal bovine serum

3.2.2人血清N-糖链的质谱分析前处理方法以5 μL健康人血清为研究对象，直接使用方法2进行酶解，并对酶解后样品用上述4种糖链富集纯化方法（微晶纤维素柱结合阳离子交换树脂柱、C18柱结合石墨碳柱、C18柱结合阳离子交换树脂柱和石墨碳柱结合微晶纤维素柱）进行富集纯化，考察各个方法富集纯化微量生物样品的效果。结果表明，前3种方法的纯化效果均不稳定，通用性不强，常导致纯化失败，表现为两类特征：（1）无目标峰，杂质峰呈典型的正态分布状（如图6A所示的微晶纤维素结合阳离子法，而 C18结合阳离子柱结果与其相似，质谱图略），此类谱图表明样品中还含有大量蛋白杂质；（2）杂质峰信号强度太高，掩盖了低丰度的目标峰。例如，图6B（C18结合石墨碳）所示的谱图中，4个分子离子峰是目标峰，未检测到文献［15］报道的低丰度糖链。这可能由于样品中仍然存在表面活性剂SDS等杂质，降低了糖链的离子化效率，基线漂移。

图6 纯化失败的健康人血清N-糖链的正离子模式的ESI-MS分析谱图Fig.6 MS spectra of N-linked glycans subjected to a failing purification in healthy human serum glycoproteins by positive ion ESI-MS analysis

对上述酶解后的样品，采用石墨碳柱结合微晶纤维素柱进行富集纯化，结果令人满意。进一步对该纯化方法进行了优化改进。在用石墨碳柱进行纯化时，为避免被吸附的游离糖链洗脱不完全，改用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液作洗脱剂。由于微晶纤维素的前处理时间与装柱填料的多少成正比，根据上样量调整装柱填料量，能有效减少纯化时间。对微量生物样品糖蛋白的N-糖链进行富集纯化，只需要少量的微晶纤维素填料，可大大减少纯化时间。采用本方法处理人血清样品，质谱检测结果见图7和图8。结果表明，人血清糖蛋白上的N-糖链含量多，且结构复杂，既有中性糖又有酸性糖，能够同时在正、负离子模式下检测到，并且单电荷和多电荷形式同时存在。在正离子模式下检测到30条中性糖链，其中22条与文献 ［8，16］一致；新发现8条糖链，即 m/z 1444.33，1688.42，1751.17，1954.42，2151.17，1083.75，2427.83和2289.18。在负离子模式下，共检测了16条糖链，其中12条糖链与文献［8，16］一致，新发现4条糖链，即m/z 2133.00，2295.91，2384.00和791.67，其单糖组成见表2和表3。

图7 健康人血清中N-糖链的正离子模式的ESI-MS分析谱图Fig.7 Positive ion ESI-MS analysis of N-linked glycans from a control human serum

上述结果表明，经过改进的微量生物来源样品N-糖链质谱前处理纯化方法，同时实现了分离、纯化、浓缩过程，操作简单，适用于微量样品的检测前处理。

图8 健康人血清中N-糖链的负离子模式的ESI-MS分析谱图Fig.8 Negative ion ESI-MS analysis of N-linked glycans from a control human serum

表2 正离子模式下人血清中N-糖链的结构推测表Table 2 Composition of N-linked glycans from a control human serum in positive ion mode

表3 负离子模式下人血清中N-糖链的结构推测表Table 3 Composition of N-linked glycans from a control human serum in negative ion mode

4 结论

糖组研究的首要目标是尽可能获得样品中全部的糖链。由于糖链种类多，丰度不一，相对于蛋白质的含量差距悬殊等，要获得所有的糖链，首先要采用合适的糖链解离方法；其次要选择合适的富集纯化方法。

本研究在电喷雾质谱检测技术的基础上，建立了更适合于微量生物来源样品糖蛋白N-糖链解离、富集纯化的方法。本方法利用PVDF膜富集复杂生物样品中糖蛋白，用PNGase F直接在膜上完成糖蛋白中糖链的解离；同时提高糖链解离纯化效率。通过比较几种糖链富集纯化方法，最终筛选出微晶纤维素柱结合石墨碳柱进行糖链的富集纯化的方法，并成功应用于微量生物来源样品如血清中（μg级）糖蛋白的N-糖链的质谱分析前处理。本方法快速、稳定、通用性好，能够用于N-糖链的高通量制备，有利于糖链定量分析和结构解析研究。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.31170773，31370804 and 31300678 ）

Pretreatment Method for Detecting of N-linked Glycans of Glycoprotein in Micro-scale Complex Biological Sample based on Electrospray Ionization Mass Spectrometry

ZHANG Ying，LIU Ying，LIU Yang，QIANG Shan，YANG Bing-Ying，HUANG Lin-Juan，WANG Zhong-Fu*
（Life Science College，Northwest University，Xi′an 710069，China）

A reliable，efficient and simple method was developed for releasing，enrichment and purification of N-glycan from glycoprotein based on electrospray ionization mass spectrometric （ESI-MS）detection technology.The bovine ribonuclease B（Rib B）and ovalbumin were used as model glycoprotein samples andsubjected to direct enzymolysis to investigate the purification effects of four different purification methods.Then the enzymatic efficiency of micro-scale complex fetal bovine serum sample subjected to direct and indirect enzymolysis after polyvinylidene fluoride（PVDF）membrane enrichment was fully investigated.Finally，a pretreatment method of N-linked glycans from glycoprotein in micro-scale complex biological sample analyzed by ESI-MS was established.The PNGase F was exploited for directly releasing of glycans from glycoprotein enriched on PVDF membrane（37℃，24 h）.Then microcrystalline cellulose chromatography column combined with graphite carbon chromatography column was used to enrich and purify glycans from enzymolysis products.The assay was eventually applied to pretreatment of N-glycan in micro-scale biological samples（μg level）of fetal bovine serum and healthy human serum for MS analysis.The method with universality showed good prospects in pretreatment of N-glycan in micro-scale biological sample for MS analysis.

Micro-scale analysis； Glycoprotein； N-Linked glycans； Electrospray ionization mass spectrometry；Pretreatment

11 April 2015；accepted 7 July 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150119

2015-04-11收稿；2015-07-07接受

本文系国家自然科学基金（Nos.31170773，31370804，31300678）资助

*E-mail：wangzhf@nwu.edu.cn