张盼盼，商鹏飞，田方圆，韩瑞丽，蒋瑞瑞，孙桂荣，康相涛，刘小军，田亚东

(河南农业大学牧医工程学院，河南省家禽种质资源创新工程研究中心，郑州 450002)



鸡Visfatin蛋白的原核表达、纯化及其活性研究

张盼盼#，商鹏飞#，田方圆，韩瑞丽，蒋瑞瑞，孙桂荣，康相涛，刘小军，田亚东*

(河南农业大学牧医工程学院，河南省家禽种质资源创新工程研究中心，郑州 450002)

本试验旨在通过克隆Visfatin基因，将其在原核表达系统中表达并纯化，通过3T3-L1细胞的分化验证其活性，成功获得鸡重组Visfatin蛋白。以AA肉仔鸡肝组织总RNA为模板，qRT-PCR扩增Visfatin基因，转化进入pGEM®-T载体，再与原核表达载体pET-30a连接转化，获取含pET-30a-Visfatin重组质粒的E.coliBL21(DE3)表达菌株。以IPTG诱导重组菌株，优化表达条件，SDS-PAGE鉴定表达情况。采用镍离子亲和层析对Visfatin蛋白进行纯化，Western blot鉴定表达蛋白，并通过3T3-L1细胞的分化情况鉴定表达蛋白Visfatin的活性。结果，通过NcoⅠ、XhoⅠ酶切获得的结果与预期目的条带大小相符，成功构建pET-30a-Visfatin表达载体。SDS-PAGE检测结果表明，在培养基pH为8.0，IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1，30 ℃条件下,诱导10～12 h时可溶性蛋白表达量最大。通过镍离子层析纯化Visfatin蛋白，在SDS-PAGE的60 ku处可见一条与预期一致的蛋白条带。Western blot证明纯化蛋白可与6*His标签特异性结合。油红O染色结果表明，与对照组相比Visfatin诱导的3T3-L1细胞有更多的脂滴形成。qRT-PCR结果显示，在3T3-L1细胞分化过程中，Visfatin作用下标志基因PPARγ、aP2、FAS和C/EBPα的表达量显著增加(P<0.05)。本研究成功建立了一套标准化的鸡Visfatin重组蛋白表达程序，获得了具有生物活性的鸡Visfatin，为其在家禽领域的进一步研究奠定了基础。

鸡重组Visfatin；克隆；原核表达；条件优化；3T3-L1

内脏脂肪素(Visfatin)由A.Fukuhara等在2005年发现并命名[1]，其实质与前B细胞克隆增强因子(PBEF)、烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)相同[2-3]，是一种分泌蛋白，由493个氨基酸组成，其大小约为52 ku。……