吴迪，祁永华，李艳薇，张春蕾，王业秋，张宁，李建民

(黑龙江中医药大学 佳木斯学院 中药部，黑龙江 佳木斯 154007)

欧前胡素治疗黄褐斑作用机理研究△

吴迪，祁永华，李艳薇，张春蕾，王业秋，张宁，李建民*

(黑龙江中医药大学 佳木斯学院 中药部，黑龙江 佳木斯 154007)

目的研究欧前胡素对人黑素瘤细胞(A375细胞)合成黑素的影响，探讨白芷主要成分欧前胡素对黄褐斑治疗作用机理。方法试验分为空白对照组、雌二醇阳性对照组和欧前胡素浓度为1、10、20、40、60、80 μmol·L-1给药组，用上述各组处理A375细胞，用MTT法、NaOH裂解法、多巴氧化法和RT-PCR法检测A375细胞活性、黑素含量、酪氨酸酶(TYR)活性、酪氨酸酶相关蛋白-1、2(TRP-1、TRP-2)、MAPK通路细胞外信号调节酶1、2(ERK1、ERK2)以及氨基末端激酶2(JNK2)的信使RNA表达。结果阳性对照组对A375活性无影响(P>0.05)；欧前胡素浓度在40 μmol·L-1以上时，可导致A375细胞大量凋亡(P<0.01)；浓度在1～20 μmol·L-1时，对A375细胞黑素合成及TYR活性有明显抑制作用(P<0.05或P<0.01)，浓度为20 μmol·L-1的欧前胡素对A375细胞TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2及JNK2的mRNA表达具有显著抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论欧前胡素可通过抑制A375细胞中TYR活性或阻断黑素合成信号的传导，治疗或预防黄褐斑。

欧前胡素；黄褐斑；黑素瘤细胞；白芷

随着生活水平的提高，人们更注重容颜的保养，黄褐斑的出现对于爱美女性来说是不可容忍的“容颜杀手”。黄褐斑是局部皮肤过多沉积色素而产生淡黑色或淡褐色斑点。黄褐斑的产生主要由于患者病变部位黑素细胞中酪氨酸酶(TYR)活性增强，促进黑素合成速度加快，导致病变部位黑素多于正常皮肤，形成色斑[1]，因此抑制酪氨酸酶活性及其遗传信息的表达是治疗黄褐斑最行之有效的途径。研究发现，白芷对黄褐斑的治疗有较好的效果[2-3]，因其良好的黄褐斑治疗效果和美容应用价值[4-5]，很多祛斑美白中药方剂或化妆品都加入白芷，但现代药学对其治疗机理深入探究的报道较少。欧前胡素是白芷的有效成分[6-7]，本研究以其为目标成分，初步研究白芷对黄褐斑的治疗机理。

1 材料

欧前胡素(上海士锋生物技术有限公司，批号：20140506)；二甲基亚砜(DMSO，上海鼓臣生物有限公司，批号：14112502)；人黑素瘤细胞(上海拜力生物科技有限公司，批号：#14062513)；雌二醇(上海亦瑞生物技术有限公司，批号：20150112)；黑色素细胞培养基-2(MelM-2，上海睿安生物科技有限公司，批号：20140807)；JNK抑制剂(美国Selleck公司，批号：S130501)；逆转录试剂盒(北京智杰方远科技有限公司，批号：14072610W)；RT-PCR试剂盒(北京义翘神州生物技术有限公司，批号：A826KA5248)。

2 方法

2.1 分组

分为空白对照组：黑素瘤细胞 + MelM-2完全培养液，正常培养72 h；阳性对照组：黑素瘤细胞+雌二醇+MelM-2完全培养液，培养72 h；给药组：黑素瘤细胞 + 欧前胡素 + MelM-2完全培养液，培养72 h，欧前胡素浓度设6个质量浓度，分别为1、10、20、40、60、80 μmol·L-1。

2.2 黑素瘤细胞培养

2.2.1 96孔板培养 取对数生长期的A375细胞，经消化后，接种于96孔板上，按照每孔5×104个细胞，接种100 μL细胞悬浮液，每组设6个复孔，在5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h，进行分组后继续培养48 h。

2.2.2 6孔板培养 取对数生长期的A375细胞，经消化后，接种于6孔板上，按照每孔1×106个细胞，每孔3 mL细胞悬浮液，每组设4个复孔，在5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h，进行分组后继续培养48 h。

2.3 MTT法检测细胞活性

96孔板在细胞培养结束前5 h时，各组每孔加入浓度为5 mg·mL-1的MTT 0.02 mL，继续培养至设定时间。移去上清液，各孔加入DMSO 150 μL，37 ℃振荡10 min。在酶标仪490 nm波长测定各孔的吸光度(OD)值，计算欧前胡素对黑素瘤细胞增殖抑制率。

2.4 黑素含量的测定

移去6孔板的培养液，用PBS、0.25%胰酶和MelM-2完全培养液清洗消化细胞，收集细胞悬液，4 ℃、1500 r·min-1离心4 min，去除上清液，加NaOH(1 mol·L-1)充分裂解，重悬96孔板中，每组设6个复孔，用酶标仪在490 nm处检测吸光度值。

2.5 TYR活性的测定

清理各组96孔板，每孔加入1%的Triton X-100溶液，-80 ℃将细胞充分破碎，加入浓度为0.2%的左旋多巴，水浴37 ℃恒温反应3 h，用酶标仪在490 nm处检测吸光度值。

2.6 RT-PCR体外扩增测量TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2、JNK2 的mRNA 表达

按照Trizol使用说明书对各组6孔板总RNA进行提取，以此RNA为模板逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行体外扩增，其中以β-actin为内参，引物序列见表1。扩增条件：94 ℃条件下预变性2 min、变性30 s，在各自退火温度下退火40 s，退火温度见表1，72 ℃延伸40 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。取10 μL扩增物，加到浓度为1.5%的琼脂糖凝胶中，在100 V、30 min条件下进行电泳，得到凝胶板放入凝胶成像系统中摄像，观察呈像结果，评价欧前胡素对细胞 TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2、JNK2 m RNA 表达的影响。

表1 PCR引物序列码

2.7 数据处理方法

3 结果

3.1 欧前胡素对A375细胞活性的影响

雌二醇阳性对照组与空白对照组比较，结果没有统计学差异(P>0.05)。6组不同浓度的欧前胡素与空白对照比较，质量浓度在1～20 μmol·L-1，结果无统计学差异(P>0.05)，提示A375细胞活性不受影响，此浓度范围对A375细胞增长既没有促进作用，亦没有抑制作用；而浓度在40～80 μmol·L-1，结果有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，具有统计学意义，提示此浓度范围对A375细胞具有较强的毒性作用，致使A375出现凋亡情况，不适宜进行抑制机理研究。因此，接下来的实验选用浓度为1～20 μmol·L-1。结果见表2。

表2 欧前胡素对A375细胞活性的影响结果

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 欧前胡素对黑素合成的影响

各实验组与空白对照组比较，雌二醇阳性对照组结果具有统计学差异(P<0.01)，对黑素合成具有明显的促进作用；欧前胡素组给药浓度在1～20 μmol·L-1时，结果有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，提示在此浓度范围内欧前胡素对黑素合成具有显著抑制作用，并随浓度增加抑制作用有增强趋势。结果见表3。

3.3 欧前胡素对TYR活性的影响

各实验组与空白对照组比较，阳性对照组结果具有统计学差异(P<0.01)，提示对TYR活性具有明显的增强作用；欧前胡素组给药浓度在1 ～20 μmol·L-1时，结果有统计学差异(P<0.05或P<0.01)，提示在此浓度范围内欧前胡素对TYR活性具有显著抑制作用，并随浓度增加抑制作用有增强趋势。结果见表4。

表3 欧前胡素对黑素合成的影响结果

表4 欧前胡素对黑素瘤细胞TYR活性的影响结果

3.4 欧前胡素对细胞 TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA表达的影响

在细胞 TYR、TRP-1、TRP-2 的信使RNA 表达中，比较欧前胡素组与阳性对照组和空白对照组对此信息传递的影响，欧前胡素明显降低mRNA信息的表达(P<0.05或P<0.01)，具有很强的阻断作用；阳性对照组明显增强mRNA的表达(P<0.01)。结果提示质量浓度为20 μmol·L-1的欧前胡素具有阻断黑素瘤细胞的TYR、TRP-1、TRP-2mRNA 的表达作用。结果见表5。

表5 欧前胡素组对A375细胞 TYR、TRP-1、TRP-2 m RNA 表达影响的结果

3.5 欧前胡素对细胞 ERK1、ERK2、JNK2 mRNA表达的影响

在A375细胞TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA表达中，比较欧前胡素组与阳性对照组和空白对照组对此信息传递的影响，欧前胡素组明显降低这3种mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)，具有较强的阻断作用；阳性对照组对这3种mRNA的表达具有明显的增强作用(P<0.01)。结果见表6。

表6 欧前胡素对A375细胞 ERK1、ERK2、JNK2 mRNA表达影响的结果

4 讨论

黄褐斑主要是由于黑素增多集聚在皮肤表面，多分布在面部，表现为棕色或浅棕色斑点或斑片，女性多于男性，尤其妊娠后的女性。其发病原因尚不能完全确定，研究认为日光照射、家族遗传史、内分泌失调、服用避孕药等都可能是诱发或加重黄褐斑的原因[8-10]。黄褐斑在皮肤内部形成过程中，黑素细胞扮演着至关重要的角色，其主要功能是在多步酶的催化作用下合成黑素，黑素聚集最终形成斑点。其中最关键的酶为酪氨酸酶(TYR)，酪氨酸酶催化酪氨酸掌控黑素合成的起始步骤(或称之为上游)，因此酪氨酸酶的活性和量决定了合成黑素的速度。在合成黑素时，与酪氨酸酶相关的蛋白有酪氨酸酶相关蛋白-1、2(TRP-1、TRP-2)，这两种酶主要控制合成黑素途径的下游[11-13]，决定黑素合成最终完成程度与速度。

黑素的合成不仅取决于TYR及其相关蛋白的含量和活性，还受雌性激素受体(ER)信号通路以及ER-MAPKs信号通路调节控制[14-15]，在MAPK 5个通路中，信号通路作用是细胞生长和分化调控，p38MAPK信号通路主要作用是调节炎症与细胞凋亡等应激反应。因此，筛选药物时，必须考虑TYR及其相关的蛋白和MAPK信号通路调节机理。本研究通过ERK1、ERK2和JNK等信号通路，进一步探讨欧前胡素治疗黄褐斑作用机理。

白芷为伞形科植物，性温味辛，主要成分为香豆素类的欧前胡素、异欧前胡素和挥发油类。白芷提取物具有消炎镇痛、抗菌、抗氧化、活血化瘀、保肝、抗光敏、除湿散风、美容的功能。近年来，人们重新深入地探索其在皮肤病方面的药用价值，用其治疗色素性疾病，如黄褐斑和白癜风等。有研究用复方白芷酊联合卤米松软膏治疗白癜风获得了较好的效果[16-18]。研究发现，白芷能够调节人体的微循环使之得到改善，促进皮肤新陈代谢速度，从而延缓皮肤衰老，同时可以减少色素组织中聚集过多的色素，淡化或消除面部色斑，对美白祛斑有较好的疗效[19-21]。有研究表明[2，22-23]，白芷治疗黄褐斑的作用机理是通过抑制酪氨酸酶活性和表达，阻断酪氨酸合成黑素的通路，降低酪氨酸酶催化酪氨酸合成黑素的量。但所有研究成果并未指出白芷中具体哪种成分有此功效，有待进一步研究。欧前胡素是白芷提取物中最重要的成分之一，于静等[24]发现，在紫外线照射下，能增强欧前胡素与蛋白质中的酸性物质反应，导致蛋白质结构发生改变，表明欧前胡素具有调控酪氨酸酶活性和表达的可能性。

本文以欧前胡素为目标成分，进一步探讨白芷对黄褐斑的治疗作用。本研究结果提示，欧前胡素在高剂量下直接导致黑素瘤细胞凋亡，低剂量时可以抑制TYR的活性和表达，降低黑素合成。抑制机理可能是欧前胡素抑制TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA信息的表达，同时可能抑制MAPK信号通路中蛋白激酶ERK1、ERK2、JNK mRNA信息的表达，基因信息表达受阻，从而降低黑素的合成。因此，本研究从欧前胡素抑制TYR活性和表达探讨白芷单一有效成分欧前胡素应用价值，为进一步研究如何应用白芷治疗黄褐斑和白癜风提供了参考。

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ResearchonMechanismFunctionofImperatorinTreatingChloasma

WUDi，QIYonghua，LIYanwei，ZHANGChunlei，WANGYeqiu，ZHANGNing，LIJianmin*

(TraditionalChineseMedicineDepartment，JiamusiCollegeHeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Jiamusi154007，China)

Objective：The study is aimed to research the influence of imperatorin on melanoma cell (A375 cells)，and explore mechanism function of the roots ofAngelicadahuricafor treatment of chloasma.MethodsIn experiment，control，estradiol and positive control，and experimental groups (concentration of imperatorin is 1，10，20，40，60，80 μmol·L-1) were divided to operate A375 cells.MTT method，NaOH pyrolysis，dopamine oxidation，and RT-PCR method were applied to test A375 cells activity，melanin content，tyrosine (TYR) enzyme activity，and RNA expression of tyrosinase related protein-1、2(TRP-1、TRP-2)，mark pathway extracellular signal regulating enzymes 1、2(ERK1、ERK2)and Jun N-Terminal Kinase 2(JNK2).ResultsThere existed no significance of A375 cells in positive control group(P>0.05).The concentration of imperatorin was above 40 μmol·L-1，a lots of A375 cells died(P<0.01).The concentration of imperatorin was 1-20 μmol·L-1，there was significant inhibiting effect on A375 cells melanoma cells synthesis and TYR activity.The concentration of imperatorin was 20 μmol·L-1，there was significant inhibiting effect on TYR、TRP-1、TRP-2、ERK1、ERK2 and mRNA of JNK2 in A375 cells(P<0.05 orP<0.01).ConclusionImperatorin can treat and prevent chloasma by inhibiting TYR activity in 375 cells or blocking melanin synthesis signal conduction

Imperatorin；chloasma；melanoma cells；Angelicadahurica

2016-04-18)

国家自然科学基金面上项目(81274035)；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(PC13S15)

*

李建民，教授，研究方向：中药药效物质基础；Tel：(0454)6050395，E-mail：13258119@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.009